競合的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いた固形組織中の環状グアノシン一リン酸(cGMP)の測定

デヒター研究所は一酸化窒素代謝を研究しています。一酸化窒素は適応恒常性カスケードを介して環状GMP形成を刺激する私たちは、老化、食事、その他の要因がこのカスケードにどのような影響を与えるかを知ることを目指しています。これまでの研究は、一酸化窒素の形成と、2つをつなぐカスケードを無視した場合の結果として生じる生理学的影響に焦点を当てていました。私たちのプロトコルは、カスケードのセカンドメッセンジャーである周期的なGMPを測定します。私たちのプロトコルはシンプルでアクセスしやすく、さまざまな組織タイプに簡単に適応できます。

[ナレーター]はじめに、

ティッシュ粉砕機、ピンセット、スプーンをドライアイスの上に10分間置きます。粉砕中の損失を考慮して、余分なブタ組織の重量を量ります。ドライアイスの上に置かれた冷やした粉砕機に組織を移します。液体窒素を粉砕機に注ぎ、完全に気化させてから組織を急速凍結します。次に、粉砕機の蓋を元に戻し、木槌を使用して15回叩きます。次に、ビーズホモジナイザーチューブを天びんにして風袋引きします。冷やしたスプーンとピンセットを使用して、粉砕した組織をチューブに移します。0.1 通常の塩酸を均質化チューブにピペットで入れ、マイクロリットル単位の体積がミリグラム単位の組織質量の倍数になるようにします。次に、ビーズミルホモジナイザーを使用して組織サンプルを均質化します。サンプル温度を摂氏4度に保ちながら、ホモジネートを17,000 gで30分間遠心分離します。得られた上清を微量遠心チューブに移します。サンプル温度を摂氏4度に保ちながら、再度10分間遠心分離します。最終上清のアリコートを微量遠心チューブにピペットで入れ、氷の上に置きます。次に、9.9ミリリットルのELISAバッファーを標準Bとラベル付けされたチューブにピペットで入れます。100マイクロリットルの標準原液を標準Bチューブにピペットで入れます。ボルテックスを徹底して均一なサスペンションを確保します。1,000マイクロリットルの溶液を標準Bから標準1とラベル付けされたチューブに移します。次に、500マイクロリットルのELISAバッファーを、標準0および標準2〜8とラベル付けされたチューブに加えます。ボルテックス標準 1.次に、500マイクロリットルの溶液を標準2に移します。次に、標準2をボルテックスし、500マイクロリットルの溶液を標準3に移します。500マイクロリットルを前の各規格から次の規格に移し続け、規格8が準備されるまで各版の後に徹底的にボルテックスします。サンプルのアセチル化のために、50マイクロリットルの4モル水酸化カリウムを250マイクロリットルのサンプルアリコートに加えます。すぐに12.5マイクロリットルの無水酢酸を加えます。溶液を15秒間渦にします。次に、12.5マイクロリットルの4モル水酸化カリウムをピペットで入れ、再びボルテックスします。標準0とラベル付けされたチューブに、100マイクロリットルの4モル水酸化カリウムを加え、すぐに25マイクロリットルの無水酢酸を加えます。ボルテックス後、25マイクロリットルの4モル水酸化カリウムをチューブにピペットで入れ、短時間ボルテックスします。水酸化カリウムと無水酢酸の添加を繰り返し、続いて残りの標準のボルテックスを繰り返し、ELISAバッファーとアセチル化サンプルアリコートの所定の比率を微量遠心チューブに加えます。ボルテックス標準0。標準0の50マイクロリットルのアリコートを、ELISAマイクロプレートのNSBおよびBノートウェルとして指定された5つのウェルに移します。次に、標準0を含む2つのNSBウェルに50マイクロリットルのELISAバッファーを加えます。単一のピペットチップを使用して、標準1から8の50マイクロリットルのアリコートを、標準8から標準1に進み、重複したウェルに追加します。各サンプルをボルテックスします。次に、50マイクロリットルを適切なウェルに二重または三回追加します。次に、50マイクロリットルのアセチルコリンエステラーゼトレーサーをNSB、B naught、標準、およびサンプルとして指定されたすべてのウェルにピペットで取り込みます。50マイクロリットルの抗血清を各Bナットウェル、標準ウェル、およびサンプルウェルに加えます。ELISAプレートを覆い、摂氏4度で18時間インキュベートします。インキュベーション後、ELISAプレートを廃棄物容器の上に反転させて、内容物を廃棄します。洗浄ボトルを使用してウェルに洗浄バッファーを充填します。5秒間穏やかにかき混ぜます。次に、洗浄バッファーを捨て、ペーパータオルで残りの液体を軽くたたきます。次に、エルマン試薬をリザーバーに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、200マイクロリットルのエルマン試薬をブランク、NSB、B naught、TA、標準、およびサンプルウェルにすばやく追加します。5マイクロリットルのアセチルコリンエステラーゼトレーサーをTAウェルに加えます。次に、ELISAプレートをパラフィルムで覆います。 光を保護した容器に入れ、室温で60〜90分間攪拌しながらインキュベートします。パラフィルムを取り除き、412ナノメートルでの光学密度を読み取ります対照群のブタ肝臓の環状GMP濃度は、組織1グラムあたり約0.0202ナノモルでした。硝酸塩処理群では、環状GMP濃度は組織1グラムあたり約0.0364ナノモルに増加しました。