Ookluc: Plasmodium berghei 系統による感染阻止化合物の同定

私たちの研究は、マラリアの伝播を阻止するための新しい戦略をサポートするために、ハイスループットシステムを使用して、マラリア原虫の性段階における伝播遮断化合物と必須遺伝子を同定し、特徴付けることを目的としています。このプロトコルは、受精後の寄生虫発生の発光期自動検出を備えたトランスジェニックP.berghei系統を使用することにより、伝達遮断化合物を同定するための標準化されたハイスループット方法の欠如に対処します。このプロトコルは、マラリア原虫の性段階のスクリーニングを可能にし、早期の伝達遮断化合物を検出し、正確な IC50 測定をサポートし、従来の方法よりも利点をもたらします。

まず、オキネート培地を使用して化合物ストックを1ミリモルに希釈して化合物サンプルを調製します。この1ミリモルのストックをオキネート培地で1対100の比率で希釈し、10マイクロモルの最終濃度を達成することにより、作業サンプルを調製します。1回のアッセイでは、200マイクロリットルの作業サンプルの最終容量を2回調製します。

化合物が水以外の溶媒に溶解している場合は、溶媒をオオキネテ培地で試験サンプルと同じ割合で希釈して対照サンプルを調製します。2つの96ウェルプレートを使用して、各サンプル80マイクロリットルを、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、溶媒コントロール、およびテストサンプルの指定されたウェルに、指定されたレイアウトに従って2回配置します。4マイクロリットルの寄生マウス血液を、陰性対照ウェルを除き、各ウェルに1対20の比率で追加します。

ピペッティングを上下にして穏やかに均質化します。ネガティブコントロールの場合、感染していないマウスの血液を各ウェルに1対20の比率で添加し、ピペッティングによって穏やかに均質化します。プレートを摂氏21度に設定したインキュベーターに入れ、6時間または24時間インキュベートします。

インキュベーション後、血液培地が適切に混合されるように、ピペッティングを上下にピペッティングして各サンプルを均質化します。使用直前に、溶解バッファーとルシフェラーゼ基質混合物を1対50の比率で調製します。この溶解バッファー基質混合物を各サンプルと1対1の比率で混合し、気泡を発生させることなく穏やかに混合します。

プレートを摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。次に、サンプルを96ウェルの白色平底プレートに移し、プレートリーダーを使用して発光を測定します。発光アッセイの後、プレートリーダーによって表示された生の発光データを記録します。

スプレッドシートを使用して、指定された式を使用して各測定値の平均を計算します。XX を最初の測定セルのアドレスに置き換え、YY を 2 番目の測定セルのアドレスに置き換えます。すべてのサンプルに対してこの式を繰り返します。

指定された式を使用して、データを阻害率に変換します。ここで、Aはサンプルの相対光単位値、Bは制御の相対光単位値です。阻害濃度50%測定のために95%以上の阻害を示す化合物を選択します。マウスにOoklucを感染させ、寄生した血液を採取した後、100%変換の阻害を示した初期濃度の希釈剤としてOokinete培地を使用して化合物サンプルを調製します。

サンプルを3回ずつ96ウェルプレートにピペットで、指定されたレイアウトに従ってピペットで入れます。ピペットを使用して、ウェルD1からD2に80マイクロリットルを移し、完全に混合し、次にD2からD3に80マイクロリットルを移し、このプロセスをD12まで続けることにより、2倍の連続希釈を実行します。D12から除去された最後の80マイクロリットルを廃棄して、ウェルあたり80マイクロリットルを維持します。

次に、寄生したマウスの血液を各ウェルに1対20の比率で加え、ピペッティングによって穏やかに均質化します。ネガティブコントロールウェルに、感染していないマウスの血液を1対20の比率で添加し、穏やかに均質化します。プレートを摂氏21度に設定したインキュベーターに入れ、発光アッセイを実行する前に6時間または24時間インキュベートします。

パーセンテージの抑制を計算した後、解析ソフトウェアを開き、プロット用のXYテーブルを作成します。Y 軸を設定して、3 つの反復値を並べてサブ列に入力します。xは化合物濃度を表し、yは阻害率を表し、データを表に貼り付けます。

次に、「分析」をクリックします。[非線形回帰、曲線適合]を選択し、[用量反応曲線]、[阻害]、[阻害剤対正規化応答、可変傾き]の順に選択し、[OK]をクリックします。左側のパネルで線量反応曲線を表示し、色やポイント形式の変更などのカスタマイズを適用します。

非線形近似表を見つけて、計算された IC50 と 95% 信頼区間を見つけます。ピリミジンアゼピン90は、0.125〜1マイクロモルの濃度で95%を超える阻害が観察され、0.007マイクロモル未満で活性が完全に失われ、その阻害応答における急激な閾値効果を示唆しています。ピリミジンアゼピン90データに当てはめられた用量反応曲線は、0.013マイクロモルのIC50値をもたらし、標的活性を阻害する効力が高いことを示しています。