磁性粒子イメージングを用いた肺線維症のための移植された遠位肺上皮前駆細胞の画像誘導 In vivo 追跡

本研究は、肺細胞治療における重要な送達方法としての気管挿管プロトコルに焦点を当て、肺線維症における磁気粒子イメージングを用いた細胞移植と非侵襲的追跡の最適化を目指しています。本プロトコルは、気管内断熱と磁気粒子イメージングを組み合わせて細胞分布を監視することで、肺線維症における細胞治療のin vivo追跡方法の非侵襲的手法の不足に対応しています。当プロトコルは気管内挿入による精密な局所細胞送達と磁気粒子イメージングによる優れた追跡を提供し、高感度でリアルタイムで背景ノイズなしの画像化を実現します。

まず、12週齢のオスのNODまたはSCIDマウスの体重を測り、必要なブレオマイシンの投与量を計算します。ブレオマイシン溶液を無菌生理食塩水で、所定濃度で最終体積50マイクロリットルまで1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブで準備します。その後、溶液をピペットに注入します。

注射時に200マイクロリットルの空気をあらかじめ注入し、液体全体の量が気管内に排出されるようにします。マウスに麻酔をかけた後、光ファイバープローブを喉頭鏡とカテーテルに通してファイバーライト挿管キットを組み立てます。動物の足の指をつまんで十分な麻酔を確認し、麻酔下にある場合は両目に眼科軟膏を塗布します。

マウスを斜めの齧歯類挿管台に仰向けで下がらせて前歯で吊るします。鈍頭の鉗子を使い、舌をつかみ、優しく上下かつ左に動かして喉頭を露出させ、明確に視覚化します。光ファイバープローブを起動し、口の中へ誘導して気管に近づけます。

喉頭鏡の拡大鏡を使って視界を良くし、気管開口部の声帯を特定します。カテーテルを気管口に挿入し、喉頭鏡を優しく外します。次に、カテーテルの上部に20マイクロリットルの生理食塩水を置きます。

200マイクロリットルの空気をあらかじめ充填した注射器を装着し、液滴を気管に押し込みます。次に、最大50マイクロリットルのブレオマイシンをカテーテルに注入し、空気充填シリンジで注入します。カテーテルは気管からの逆流を防ぐために5〜7秒間そのままにしてください。

その後、カテーテルを優しく外します。挿管台のマウスは少なくとも30秒間同じ姿勢で維持してください。その後、マウスをスタンドから取り出し、温熱パッドの上に置いたリカバリーケージに入れます。

マウスが完全に麻酔から回復するまで継続的にモニタリングしてください。特発性肺線維症患者からナノ粒子標識されたヒト気道上皮細胞を入手します。ブレオマイシン注入から72時間後、マウスを再麻酔し、気管内挿入手順を繰り返して50マイクロリットルの細胞懸濁液に50,000個の細胞を投与します。

磁気粒子画像撮影を行う前に、マウスを少なくとも20分間回復させます。マウスベッドを磁気粒子イメージングスキャナーに設置し、適切なコネクタを通して麻酔ラインをベッドの下に通します。マウスが麻酔されている間に、磁気粒子イメージングスキャナーを準備してください。

足の指をつまむテストで十分な麻酔を確認した後、マウスを磁気粒子イメージングベッドに慎重に配置します。マウスでベッドをスキャナーの穴に押し込み、ソフトウェアインターフェースの「スキャン開始」をクリックすると画像撮影を開始します。スキャン終了後、マウスを磁気粒子イメージングベッドから取り出し、ヒーターパッドの上に設置されたリカバリーケージに入れます。

最後に、画像解析ソフトを使って取得した画像を分析します。2D磁気粒子イメージング(MPI)信号強度は、すべての検査細胞数における酸化鉄トレーサー濃度に比例して増加しました。最適な標識濃度として250マイクログラム/ミリリットルが選ばれました。

蛍光顕微鏡検査により、細胞質および青色DAPI染色核に赤色デキストランシグナルが確認され、in vitroでの標識が成功したことが確認されました。2D MPI画像では標識細胞数の増加とともに信号強度が増加し、信号と細胞数の正の相関が確認されました。これに基づき、5万個の細胞が移植のために選ばれました。

空のベッド制御画像には背景MPI信号が見られず、スキャナーが標識付きセルに特異的であることが確認されました。観測された4つの信号は、コントロールとして用いられた基準マーカーに対応しています。標識細胞の肺への移植に成功し、両肺に目に見えるバタフライ型MPI信号が生成され、効果的な気管内送達が検証されました。

細胞の未完全設置により、肺と頸部の両方に信号が現れ、早期カテーテル除去による漏れが示唆されました。カテーテルが気管ではなく食道に誤って挿入されたことで、MPI信号が腹部の下部に現れ、胃に細胞が沈着していることを示しました。移植から14日後、切除された肺の体外画像検査により標識細胞の持続が確認されました。

本研究の成果は診断精度の向上と幹細胞治療を含む肺疾患の標的治療の開発を可能にすることで、肺画像診断および関連生物医学分野の進展と革新を加速させるでしょう。当研究室は、肺線維症に対する幹細胞療法の補強、非侵襲的画像技術の向上、細胞送達の最適化、肺線維症の治療効果のモニタリングに注力します。