天然由来のタンパク質合成阻害剤の予備スクリーニングのための蛍光ベースのプロトコル

天然由来のタンパク質合成阻害剤の予備スクリーニングのための蛍光ベースのプロトコル。タンパク質合成は高度に制御された過程、転写および翻訳を伴います。転写は主に転写因子、クロマチン修飾、調節RNAによって調節されます。

一方、翻訳は開始因子、シグナル伝達経路、RNA安定性機構によって調節されます。これらの調節システムにより、細胞は細胞機能を維持し、ストレスや損傷に効果的に対応できます。がん細胞は、高いエネルギー要求と制御不能な成長を支えるために翻訳機構を乗っ取り、タンパク質合成の調節を妨げます。

この再プログラミングは、ほぼすべての主要ながん性シグナル伝達経路の調節障害の結果であり、細胞の生存、増殖、転移を促進しつつ、細胞死経路を抑制します。この強化されたタンパク質合成はがん生存に不可欠であるため、このプロセスを標的としブロックする治療法は潜在的な治療法として有望視されています。タンパク質合成阻害剤を特定するために、以下のタンパク質合成阻害蛍光アッセイを利用できます。

実験開始前に、信頼できる結果を得るために、化合物は毒性閾値以下の適切な濃度で投与されなければなりません。開始濃度を決定するために、細胞毒性アッセイを実施して化合物のEC-50を測定します。これが不可能な場合は、このアッセイの化合物を線量依存的に試験し、最も効果的な濃度パラメータを決定することができます。

化合物の濃度が細胞死を引き起こす場合、低濃度での試験が必要となります。また、使用していない間は常に光から染料を守ることが重要です。長時間の光曝露は光漂白を引き起こし、データ品質の低下につながります。

ステップ3.1、マスターミックスAを準備し、遠心分離機チューブをAとして標識し、培地598.5マイクロリットルとタンパク質ラベル1.5マイクロリットルをAにピペット注入します。この混合物をピペットで上下にピペットして均一性を確保するために再懸濁します。次にマスターミックスBを準備します。遠心分離機チューブにBとしてラベルを付け、次にタンパク質ラベル1.5マイクロリットル、シクロヘキシミド6.6マイクロリットル、培養培地591.9マイクロリットルをBにピペットに入れます。この混合物をピペットで上下にピペットして均一性を確保するために再懸濁します。テスト化合物1マイクロリットルとビジカル1マイクロリットルを2つのウェルにピペット注入した後、マスターミックスAを両ウェルに優しくピペットで注入し、細胞の動態的破壊を防ぐために斜めにピペットをウェルの側面に押し込みます。

マスターミックスBを100マイクロリットルの未処理ウェル2つにピペットで抽出します。ピペットはウェルの側面に斜めに挿入し、細胞の動態的破壊を防ぎます。プレートを優しく叩いて、細胞内の必要な成分をしっかりと取り込むことができます。

細胞を37度で30分から2時間培養します。吸引で培地を除去します。プレートを傾け、セルの運動学的攪乱を防ぐために、ウェルの中心ではなく側面から吸引します。

次に各ウェルに100マイクロリットルのPBSバッファーを追加し、900gで5分間遠心分離します。遠心分離後は、吸引でPBSバッファーを除去することを忘れないでください。ステップ5、固定と透過化。

各井戸に100マイクロリットルの固定液を加えます。その後、暗い環境で室温で15分間培養します。次に細胞を吸引します。

細胞を100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、吸引で除去します。これを2回繰り返してください。各井戸に100マイクロリットルの透過緩衝剤を加えます。

その後、室温で10分間培養します。透過緩衝材は吸引で除去します。ステップ6、タンパク質反応と染色。

リアクションカクテルマスターミックスを準備します。遠心分離機チューブに651マイクロリットルのPBSバッファーを加えます。次に100倍銅試薬を7マイクロリットル加えます。

次に蛍光アジドを7マイクロリットル投与します。最後に、遠心分離機管に還元剤35マイクロリットルを加えます。試薬を加えるときはこの正確な順序に従い、各ウェルに反応カクテルを100マイクロリットル加えます。

細胞を室温の暗い環境で30分間培養し、光漂白を防ぎます。細胞を900gで5分間遠心分離します。吸引して細胞を洗浄し、再度吸引します。

総DNA染色の1倍を希釈し、各ウェルに100マイクロリットルを加えます。細胞を暗い環境で室温で20分間培養し、光漂白を防ぎます。プレートを900gで遠心分離して5分間行います。

細胞を100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、吸引で除去します。この手順を2回繰り返してください。最後に、100マイクロリットルの冷却PBSバッファーで細胞を再懸浮させ、画像診断の準備を行います。

ステップ8、画像診断。プレートをプレートリーダーに挿入し、倍率を20倍に設定します。GFP 469/525ナノメートルチャネルで核染色を分析します。

オートベンディングやオートフォーカスを使って画像効果を向上させましょう。テキサスレッド586/647ナノメートルチャネルで能動タンパク質合成を解析します。オートベンディングやオートフォーカスを使って画像効果を向上させましょう。

蛍光プローブは光漂白に敏感であり、これは光を帯びた放射線によって蛍光色が失われる現象です。染料は使用していない間は常に光から保護されるべきです。さらに、各井戸内のスキャン回数や照射光下での時間も制限する必要があります。

長時間の光曝光は光漂白を引き起こし、最終的にはデータ品質の低下につながります。代表的な結果を見てみましょう。ここで生細胞は緑色で示され、活性タンパク質合成は赤で示されています。

既知のタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドは、図1Bに示すように、図1Aの陰性対照DMSOと比較してタンパク質合成を大幅に減少させます。赤色蛍光の放出量は減少しています。図1Cに示される化合物1による治療は、細胞剥離または細胞死のいずれかをもたらしました。したがって、そのタンパク質合成阻害活性について決定的な主張はできません。

これは、低濃度でのタンパク質合成を阻害するかどうかを調べるためのさらなる用量反応研究が必要です。化合物2は図1Dに示されるように中程度のタンパク質合成阻害を示します。この蛍光測定法は貴重な研究ツールであり、学部生の教育に役立つ化学生物学的手法として利用可能です。

最小限のデータ処理でアクセスしやすく効率的なプロトコルを提供することで、学生に実践的な経験と最新の創薬技術を提供し、創薬プロセスを加速させます。このプロトコルは蛍光基質と高度な蛍光顕微鏡技術を用いて、天然生成物化合物1および2の阻害能力を体系的に検出・測定します。シクロヘキシミドを基準阻害剤として用いると、両天然産物はタンパク質合成阻害の度合いに異なりを示しました。

新しいタンパク質合成阻害剤の需要が高まる中、このアプローチは学部生に意義ある研究機会を提供するとともに、がん治療の進歩にも貢献します。