マウス網膜におけるグリア相互作用を研究するための ex vivo 外植片モデル

私たちは、世界中の不可逆的な失明の主な原因である緑内障の神経炎症を理解したいと考えています。具体的には、網膜内のグリア支持細胞が疾患進行中のニューロンの喪失にどのような影響を与えるかを研究しています。

アストロサイトやミクログリアなどのグリアは緑内障の進行に影響を与えると考えられていますが、生きた動物モデルで神経細胞の機能を研究するために使用されるツールの多くは、これらの細胞には適していません。網膜外植片は神経炎症とグリア機能の研究に使用されますが、学習曲線は急です。私たちのプロトコルは、より親しみやすくなり、うまくいけば、この技術のより広範な採用が可能になります。

従来のin vitro細胞培養と比較して、当社の外植片アプローチは網膜内側の細胞の自然環境をよりよく保存し、その生理学的機能をより正確に調査することができます。

[ナレーター]まず、抽出したマウスの眼を、滅菌された室温のPBSで満たされた解剖皿に入れます。適切な保持点を特定し、角度の付いた鉗子でつかみ、角膜から視神経までの前後軸が水平に配置されていることを確認しながら、水中に置いたラボワイプに目をそっと置きます。角度の付いた鉗子でしっかりと保持しながら、11番メスの先端を使用して、角膜が強膜に移行する輪部と平行で約0.5ミリ後方に切開します。スプリングハサミの片方の刃を地球儀の内側に挿入し、目の周りを周囲に切り、必要に応じて鉗子で位置を変更します。輪縁周囲の切断が完了したら、鉗子で前眼部とレンズを取り外します。視神経の長い部分が残っている場合は、細いハサミを使用して1〜2ミリメートルの長さにトリミングします。次に、アイカップを上を向くように回転させ、目視検査を可能にし、硝子体の除去を容易にします。角度の付いた鉗子を使用してアイカップを固定し、網膜に目に見える損傷がないか検査し、網膜色素上皮または脈絡膜からの色素沈着細胞の破片がないか硝子体腔を調べます。改造されたトランスファーピペットを使用して、硝子体チャンバーをPBSで洗い流し、気泡を防ぐためにピペットチップを水没させたままにします。次に、細い水彩ブラシで、網膜との接触を最小限に抑えながら、大きな破片を優しく取り除きます。しつこい破片の場合は、先端の細い鉗子を慎重に使用し、網膜に金属が直接接触しないようにしてください。目に見える破片を取り除いた後、トランスファーピペットからPBSで硝子体チャンバーを3〜5回洗い流し、細いブラシを使用して周辺近くで残留毛様体要素をプローブし、ブラシ繊維の抗力によって硝子体を検出します。硝子体のポケットが残っている場合は、網膜の損傷を防ぐために繊維を浅い角度で引きずり続けながら、ブラシで周囲に向かって外側に掃きます。先端が触れた状態で鉗子を閉じた位置に持ち、取り扱い中に形成された自然な隙間を使用して、網膜と脈絡膜の間にそっと挿入します。鉗子の平らなアームを使用して、完全な分離が達成されるまで、網膜と脈絡膜の間のスペースを徐々に拡大します。1対の鉗子でサンプルを安定させ続け、2対の鉗子を使用して強膜と脈絡膜を含むアイカップをそっと下に引っ張ります。網膜がアイカップと一緒に下降する場合は、鉗子を使用して、視神経乳頭を避けて、残りの接続点を優しくプローブして取り外します。次に、網膜が視神経乳頭に固定されたまま、組織を安定させ続け、2番目の鉗子を使用して視神経乳頭の下にアイカップを束ねます。網膜周辺が硝子体の残存により折り畳まれていないこと、特に毛様体が残っている部位を検査します。必要に応じて、トランスファーピペットを使用してチャンバーをPBSで洗い流し、ブラシを使用して折りたたまれた網膜をそっとほどき、余分な硝子体を取り除きます。網膜が両側から露出した後、バネはさみを使用して、網膜周辺から視神経乳頭に向かって約90度離して一連の緩和カットを行います。水没した組織を持ちながら、鉗子を使用してラボ用ワイプをサンプルから横方向に引き離し、網膜に触れずに皿から取り出します。網膜を所定の位置に保持したまま、バネハサミを使用して網膜のすぐ下にある視神経を切断します。次に、皿から残っているアイカップティッシュを慎重に持ち上げて取り除きます。次に、35 mm のペトリ皿に PBS を入れ、鉗子を使用して、しわがないように、粗いつや消し面を上に向けて下部にフィルターを正方形に置きます。次に、トランスファーピペットを使用して、網膜を穏やかに吸引し、ペトリ皿に移します。ブラシを使用して、内面を上に向けて網膜の向きを合わせ、フィルターの正方形の真上に配置します。PBSをゆっくりと吸引して、網膜をフィルターに下げます。 網膜がフィルターに装着されたら、ブラシを使用して周辺のひだをそっと広げます。網膜の安定性と水分補給のバランスをとるために PBS レベルを調整し、組織を乾燥させることなくスムーズなブラシの動きを可能にします。次に、トランスファーピペットを使用して約1センチメートル上からPBSを滴下し、表面をすすぎ、網膜に破片がないか再度検査します。35ミリの皿の蓋を閉めて、バイオセーフティキャビネットに運びます。密閉皿は、内面や機器に接触せずにバイオセーフティキャビネット内に置きます。無菌作業に移行するときは滅菌または手袋を交換し、外植片培地をあらかじめロードした6ウェルプレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移します。キャビネット内で、35ミリメートルの皿の蓋を外し、角度の付いた鉗子を使用して、網膜に触れずにフィルターを正方形に持ち上げます。次に、6ウェルプレートを開き、フィルターを1つのウェルのインサートの中心にゆっくりと下げ、ゆっくりと培地に浸します。網膜がフィルターから分離したら、フィルターをゆっくりと脇に移動し、角度の付いた鉗子を使用してウェルから取り除きます。1ミリリットルのピペットを使用して、インサートから500マイクロリットルの培地を吸引し、インサートと気液界面の間の網膜を捕捉します。最後に、6ウェルプレートの蓋を元に戻してインキュベーターに戻し、網膜がウェル内の中央に保たれるようにします。網膜グリアの大規模な変化を調べるために、3日間の外植網膜を、培養する代わりに単離直後に固定された偽の外植片と比較しました。偽網膜のミクログリアは規則的で重複しない分布パターンを示しましたが、3日目までに移植された網膜の組織は不規則になり、細胞がクラスター化して現れ、移動を示唆しました。偽網膜の網膜星状細胞は、脈管系と密接に並んでおり、in vitroで3日後に有意に減少しました。ミューラー細胞におけるGFAP発現は、偽網膜ではかすかまたは存在しませんでしたが、in vitroで3日目までに、特に組織の端近くではっきりと見えるようになりました。in vitroで1日後、ミクログリアはプロセスの収縮と活性化の初期兆候を示し、3日目までにコンパクトなアメーバ形態に進行しました。24時間時点で、Brn3aを使用して定量化された網膜神経節細胞密度は、偽の外植片よりも培養外植片の緩やかではあるが顕著な減少を示しました。恒常性ミクログリアマーカーであるTMEM119は、偽網膜で高度に発現していましたが、in vitroで3日後にはほとんど検出されませんでした。ヒアロサイトをマークするCD206発現は、3日間のin vitro培養後も安定したままでした。GFAP染色により、解剖および取り扱い中に被った機械的損傷部位周辺のアストロサイトおよびミューラー細胞の反応性が明らかになりました。