特発性肺線維症の洗練されたマウスモデル

肺線維症は、線維性瘢痕と肺胞の気管支化を特徴とする壊滅的で不可逆的な疾患です。この研究は、肺線維症の病理をより厳密に模倣する改良された方法をマウスに導入することにより、既存の動物モデルの限界に対処します。肺線維症の標準モデルでは、ブラディオミシンの単回投与の気管間注射を使用しますが、主要な特徴を模倣することはできません。故障A反復注入を用いた方法が開発されていますが、時間がかかり、死亡率が高くなります。肺線維症を誘発するために、2回繰り返す中咽頭注射を使用します。これは、障害A反復注射モデルと比較して時間を節約し、マウスの死亡率を低下させながら、病気の中核的な特徴を要約します。

[ナレーター]まず、中咽頭投与前に各マウスの体重を量り、体重に基づいて必要なブレオマイシン溶液の量を計算します。マウスを気管注射スタンドに置き、歯を引っ掛けて固定します。鉗子を使用して、舌をそっと伸ばし、親指と人差し指で保持します。マウスの鼻を中指で覆い、溶液が適切に供給されるようにします。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、必要な量の希釈したブレオマイシン溶液を吸引し、ピペットチップの深い挿入を避けて、溶液をゆっくりと中咽頭に投与します。マウスをスタンドから取り外し、加熱パッドの上に置いて回復します。マウスを安楽死させた後、胸骨正中切開術を行って胸腔を開きます。10ミリリットルの氷冷PBSを使用して右心室を介して肺を灌流し、血球を洗い流します。カニューレを気管に挿入し、1% パラホルムアルデヒドを使用して肺を膨らませて、組織を完全に固定します。肺を切除し、室温で1%パラホルムアルデヒドに1時間浸して固定します。組織処理のために、固定組織をPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。70% エタノールを使用してサンプルを脱水し、完全な脱水を保証します。脱水後、室温で1時間キシレンで組織を除去します。次に、組織を摂氏60度の溶融パラフィンワックスに少なくとも2時間、または完全に浸潤するまで埋め込みます。回転式ミクロトームを使用して、埋め込まれた組織を7マイクロメートルのスライスに切断します。ヘマトキシリンとエオシンの染色では、キシレン脱パラフィンを2回5分間連続して行います。次に、スライドを100%エタノールで5分間再水和します。95%エタノールで1分間、80%エタノールで1分間再度再水和します。蒸留水ですすいでください。ヘマトキシリンで組織を5分間染色します。水道水で3回すすぎ、5分間水に浸します。次に、80%エタノールに1分間浸し、エオシンで45秒間対比染色します。段階的なエタノールで脱水した後、5分間2回浸してキシレンでスライドを除去します。次に、中性バルサムを使用してサンプルを取り付けます。マス染色の場合は、脱ワックス後、スライドを二重蒸留水ですすぎ、ポンソー S フクシオンで 5 秒間染色します。その後、0.2%弱酸溶液で1分間すすいでください。ホスホモリブジン酸溶液中で5分間分化します。その後、もう一度弱酸で1分間すすいでください。アニリンブルーを使用して1分間対比染色した後、再び弱酸ですすいでください。段階的なエタノールで切片を再度脱水した後、キシレンでスライドをクリアし、樹脂で取り付けます。免疫組織化学染色の場合、パラフィン包埋スライドを脱ワックスおよび再水和した後、スライドを沸騰した0.1モルのクエン酸ナトリウム緩衝液に0.5%で90秒間入れることにより、抗原回収を行います。3%過酸化水素による内因性ペルオキシダーゼ活性の消光PBS中の0.5%トライデント×100を使用して膜を透過処理し、非特異的結合をブロックします。スライドに一次抗体を加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。種が一致した二次抗体を加え、室温で1時間再度インキュベートします。次に、ストレプトアビジン-HRPを加え、免疫組織化学ステップを繰り返した後、免疫蛍光染色のために30分間インキュベートします。ビオチン化ターゲットをストレプトアビジンAlexa Fluor 594または647で1〜500希釈で室温で30分間標識します。DAPIで核を20マイクログラム/ミリリットルで5分間対比染色し、退色防止封入剤を使用してスライドをマウントします。この図は、ブレオマイシンの単回投与と反復投与の間の肺線維症の組織病理学的差異を示しており、損傷後 14 日でヘマトキシリンとエオシンが染色された切片を示しています。特に、反復ブレオマイシンモデルは、密な線維性クラスターによって特徴付けられる単回投与群よりも持続的でより広範な線維芽細胞病巣を示しました。 損傷後60日目の反復ブレオマイシン治療マウスの肺切片は、肺胞構造の有意な歪みを伴う単回投与群と比較して、より広範な線維化リモデリングを示しました。マッソンのトリクロ染色により、単回投与群と比較して反復モデルにおけるコラーゲン沈着の増加が明らかになりました。免疫組織化学は、反復群でアルファ平滑筋アクチンとヒドロキシプロリンの発現の上昇を示し、ケラチン5陽性上皮細胞の顕著な増加とともに、持続的な筋線維芽細胞活性とマトリックス蓄積を示しています。免疫蛍光法により、単回投与の肺には存在しない反復モデルでのみデルタ N p63 陽性の基底細胞クラスターが明らかになりました。さらに、特発性肺線維症の特徴的な特徴に似た反復モデルでは、ハニカムのような嚢胞構造が観察されました。肺胞上皮の気管支化は、反復損傷群でも明らかでした。