MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

Dr.Haiku Dal Linkの研究室へようこそ。新しい幹細胞治療の評価のためにこのプロジェクトに資金を提供してくださったCalifornia Institute of Regenerative Medicineに感謝します。注入された細胞をin vivoで非侵襲的に追跡することが重要です。

これは、MRイメージングまたは光学イメージング用の特異的または多機能造影剤で細胞をin vitroで標識することで可能になります。このビデオでは、その後のin vivoイメージングのために、ヒト間葉系幹細胞およびヒト胚性幹細胞を標識する方法を示します。こんにちは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校放射線科分子機能イメージングセンターの造影剤研究グループのトビアス・ヘニングです。

今日は、ヒト間葉系幹細胞をペリック、カロン、およびヒト胚性幹細胞にフェムオキシドでin vitroで標識する手順をお見せします。この技術は、注入された細胞をin vivoで局在化するため、またはそれらの機能状態に関する情報を取得するために有用です。MRIコンシャス剤による細胞標識の手順は、胚性幹細胞と間葉系幹細胞で異なりますが、どちらの技術も、細胞培養物に付着するように細胞をプレーティングしている細胞培養の準備、標識の準備、幹細胞の単純なインキュベーショントリプシンによる細胞の培地標識、および標識効率と細胞生存率のフリー意識剤の評価を洗い流すというステップが含まれます。

それでは、始めて、いくつかのセルにラベルを付けましょう。それでは、間葉系幹細胞をTheo Carbatrolで標識することから始めましょう。まず、MRイメージングのために、ヒト間葉系幹細胞をテオキャロンと酸化鉄ベースの造影剤で標識する技術を示します。

まず、我々は、80%の合流点でT 75フラスコのラベリング手順の18〜24時間前に細胞をプレートします。そうでなければ、翌日、平方センチメートルあたり約10, 000細胞に等しい別の培養皿を使用する場合、我々は、8ミリリットルの無血清培地に30マイクロリットルのレリシストを添加することにより、ラベリング培地を準備することから始めます。これにより、1つのT 75 FLAが80%の同時流暢さでラベル付けされ、メディア1ミリリットルあたり100マイクログラムの鉄の濃度に相当します。次に、培養培地を取り出し、PBSまたは無血清培地で細胞を一度洗浄します。

これは、造影剤に結合し、標識効率に影響を与える可能性のある残留血清タンパク質や培地の他の成分を取り除くために行われます。ラベリングメディアをフラスコに加え、フラスコをインキュベーターに戻します。2時間後、FCSの最終濃度が20%になるように、FCSを2ml追加します。

これは、細胞が死んでいることを区別するための刺激を受け取らず、慣れ親しんだ環境で成長しないようにするためです。次に、細胞を18時間インキュベートします。翌日、PBSで細胞をすすぎ、次に遊離造影剤を取り除くために、標準的な培養プロトコルに従って細胞をgizeします。

Trypsが初期化されると、細胞懸濁液を400 RCFで5分間遠心分離して3回洗浄し、PBSで再懸濁します。それです。最終的な細胞Pは再懸濁することができ、さらなる実験の準備ができています。

前の洗浄ステップで細胞を失った可能性があるため、今は細胞を数えます。また、この時点でトリッピンブルー排除アッセイを使用して生存率試験を行い、分光分析のためにいくつかのサンプルを採取して標識効率を測定します。では、ヒト胚性幹細胞をフェムオキシドで標識する方法をご紹介します。

まず、ヒト胚性幹細胞を10cmの皿にプレートします。通常どおり、これらの皿はゼラチンで事前にコード化されており、フィーダー細胞が照射されています。このプロトコルは、フィーダーフリー培養にも使用できます。

ヒト胚性幹細胞を付着させて約3〜4日間成長させ、中型のコロニーを形成します。この間、コロニーが大きいほど分裂しにくくなるため、コロニーが大きくなりすぎないようにします。その後、分化した細胞がこれらの培養物を汚染する可能性があります。

ですから、コロニーの清浄度によっては、解剖によって分化した培養物を取り除かなければならないかもしれません。次に、1ミリリットルあたり100マイクログラムの鉄の濃度の定理酸化物と完全なヒト胚性幹細胞培地からなる標識培地を調製します。このために、89マイクロリットル、フェム酸化物、および10ミリリットルの全成長培地を混合します。

間葉系幹細胞については、死んだ細胞や破片を取り除くために、完全な培地で一度皿を洗います。次に、皿ごとに10ミリリットルの標識培地を加え、細胞を4時間インキュベートします。これでラベリングは完了です。

次のステップでは、細胞を洗浄し、単一細胞懸濁液を得る必要があります。さらに使用するために このために、最初に皿をPBSですすいでください。ここで、PBSを5ミリリットルの0.25%トリプシンに交換し、インキュベーター内で5分間、または細胞が剥離するまでインキュベートします。

細胞が分離した皿を頻繁に叩くと役立ちます。皿に大きなコロニーが含まれていた場合、それはこれらの塊を取り除くために残っているいくつかの塊である可能性があることに注意してください。血清ピペットを使用してピペッティングを上下させて懸濁液全体を完全に混合し、さらに2分間放置します。

トリプシンで。エッペンドルフのピペットは使用しませんが、すべてが正しく機能すれば、細い先端から細胞を繰り返しピペッティングすると細胞膜が壊れてしまう可能性があります。現在、ゼラチンコーティング、胚性幹細胞マトリックス、および死んだ細胞に由来する多くの破片と混合された単一細胞懸濁液があります。

これで、細胞を40マイクロメートルのセルストレーナーに通すことで、残っている塊や複合体を取り除くことができます。次に、照射されたフィーダー細胞からヒト胚性幹細胞を分離する必要があります。これは、ゼラチンでコーティングされた皿に細胞懸濁液をめっきすることにより効率的に行うことができます。

皿を操作しないと、すべての細胞が沈殿しますが、フィーダーはヒト胚性幹細胞よりも速く付着します。したがって、45分後にSUPナチンを取り外すと、主にヒト胚性幹細胞が含まれているはずですが、フィーダーは主に皿に取り付けられている必要があります。このようにして、磁気的に標識されたヒト胚性幹細胞の単一細胞懸濁液が得られ、これは前のプロトコルと同様にさらなる実験に使用できます。

この時点で、細胞をカウントし、生存率の評価と標識効率の測定のためにサンプルを採取する必要があります。さて、今日お見せしたかったプロトコルはこれで終わりです。次に、標識された幹細胞をin vivoで追跡する方法を見てみましょう。

このスライドは、OC Caroneで標識された幹細胞を示しています。マウスの脳に注入した後、75ナノリットルの容量で20, 000個の細胞を懸濁させ、脳室内ゾーンに注入しました。移植された細胞内の酸化鉄は、MRで見られる感受性アーチファクトを引き起こします。画像。

胚性幹細胞と間葉系幹細胞の標識方法を紹介しました。In vitroでMr.Contrastを使用して間葉系幹細胞と胚性幹細胞をin vivoで追跡することは、新しい幹細胞療法の評価に大きな可能性を秘めています。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そして細胞のラベリングに頑張ってください。