Name: MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-31T21:32:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶ酸化鉄ナノ粒子を用いたヒト間葉系幹細胞と胚性幹細胞の標識法。MRイメージングによる生体内非侵襲追跡技術を習得し、新規幹細胞治療の評価に応用する方法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロジェクトは、再生医療のためのカリフォルニア工科大学からレオンJ.タールのSEEDの助成金によってサポートされていました。トビアスヘニングは、ドイツ研究協会（DFG、HE 4578/1-2）から奨学金研究によって資金を供給された。我々は感謝してヒト胚性幹細胞の培養上彼のアドバイスをファニートのMenesesを確認応答したい。

FerucarbotranとhMSCのラベリング これはFerucarbotran、MRイメージングのための酸化鉄ベースの造影剤でヒト間葉系幹細胞を標識するためのテクニックです。 <ol><li>開始するには、プレート18〜24時間、80％の合流点でT75フラスコ中のラベリング手順の前に細胞。別の培養皿を使用する場合、これは1cm 2当たり約10000細胞に等しくなります。 </li><li>翌日、無血清培地8mlをするResovistの30μlを添加してラベリングメディアの準備から始まります。これは100μgのFe / mlの培地の濃度に対応する、80％コンフルエントに一つT75フラスコにラベルを付けます。 </li><li>培地を外し、PBSまたは無血清培地で細胞を1回洗浄する。これは、残留血清タンパク質と造影剤と影響力の標識効率を結合することができるメディアの他の成分を取り除くために行われます。 </li><li>フラスコにラベルメディアを追加し、インキュベーターにフラスコを戻す。 </li><li> 2時間後、20％FCSの最終濃度が達成されるように、FCSの2ミリリットルを追加します。これは、細胞が分化して刺激を受けていないことを保証するために行われますが、代わりに使い慣れた環境で成長しています。 </li><li> 18時間にわたって細胞をインキュベートする。これは最高の一晩に行われます。 </li><li>翌日、PBSで細胞を洗い流した後、それらをいつものようにトリプシン処理。 </li><li>一度トリプシン、細胞懸濁液は、メディア内の残留、フリー造影剤を取り除くために3回洗浄する必要があります。これは、PBSで5分間で400 rcfで、細胞を遠心分離することで行われます。 </li><li>最終的に細胞ペレットを再懸濁し、さらなる実験のために準備ができます。 </li><li>一部は前の洗浄ステップの間に失われた可能性があるとして、現在のセルを数える。また、トリパンブルー排除アッセイを使用して、この時点で実行可能性のテストを実行し、標識効率を測定する分光分析のためにいくつかのサンプルを取る。 </li></ol> Ferumoxidesでヒト胚性幹細胞の標識 <ol><li>開始するには、プレート10cmの皿でヒトES細胞、いつものように。これらの料理は、ゼラチンをプレコートされ、それらの上に照射したフィーダー細胞を持っている。あなたにもフィーダーフリーの培養のためにこのプロトコルを使用することができます。 </li><li>彼らは中規模のコロニーを形成するようにヒトES細胞をアタッチし、約3-4日間に成長しましょう​​。この時間の間に、コロニーが大きいコロニーは後で分割することがより困難であるとして、大規模に成長していないことを確認してください。 </li><li>分化した細胞は、そのコロニーの清浄度に応じて、これらの培養物を汚染することができます、あなたは、解剖によって差別化された文化を取り除くために必要があります。 </li><li> 100μg/mlと完全なhESCのメディアの濃度でFerumoxidesから成るラベル、メディアを準備します。このため、我々は、89μlFerumoxidesと完全増殖培地10mlを混ぜる。 </li><li>完全なメディアで一度皿を洗ってください。 </li><li>皿あたりのメディアのラベル付けの10 mlを添加し、4時間細胞をインキュベートする。 </li><li>今、ラベルは完了です。次のステップでは、細胞を洗浄し、さらに使用するために、単一の細胞懸濁液を得ることが必要です。この場合、最初のPBSで皿を洗う。 </li><li>その後、0.25％トリプシン5mlのでPBSを交換し、5分間インキュベーター内でインキュベートする、または細胞がデタッチされるまで。それは頻繁に料理をタップするのに役立ちます。 </li><li>セルは切り離されている。料理は大きなコロニーが含まれていると残って塊があるかもしれないことに留意してください。 </li><li>これらの塊を取り除くために、いずれかの血清学的ピペットを使用して一度全部停止を混在させることができる、それは別の2分間放置します。 </li><li>我々は、細胞膜を破ることができる細いチップを通して、細胞のように繰り返し吸引をエッペンドルフピペットを使用しないでください。 </li><li>残留塊が存在する場合、一つは40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を実行することができます。 </li><li>すべてが正しく機能する場合、単一の細胞懸濁液はゼラチンコーティング、ESC -行列と死細胞に由来する、破片の多くと混合されている存在。このを取り除くために、5分間、400 rcfで、それらをスピンダウンして細胞を2回洗浄し、完全なメディアで再懸濁します。 </li><li>今、ESCは照射フィーダー細胞から分離する必要があります。これは、ゼラチンコートしたディッシュに細胞懸濁液をめっきすることによって効率的に行うことができます。 </li><li>料理が操作されていない場合は、すべての細胞が堆積物下になりますが、フィーダーはESCより速くアタッチされます。 </li><li>フィーダは主に料理に添付する必要がある一方そう、上清を45分後に撮影されている場合、それは、主にESCが含まれている必要があります。 </li><li>この方法では、さらなる実験のために使用することができる磁気標識されたヒト胚性幹細胞の単一細胞の懸濁液が得られる。 </li><li>以前のプロトコルと同様に、この時点では、セルをカウントし、ラベリング効率の実現可能性評価と測定用サンプルを採取する必要があります。 </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+MR+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents.</a> 228, 760-767 (2003).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+iron+oxide+labeled+human+hematopoietic+progenitor+cells+in+a+xenotransplant+model%3A+in+vivo+monitoring+using+clinical+magnetic+resonance+imaging+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment.</a> Radiology. 234, 197-205 (2005).</li>
<li>Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+with+the+positive+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Gadofluorine+M.+Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell labeling with the positive MR contrast agent.</a> Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).</li>
</ol>

幹細胞の非侵襲的な描写は、ほぼすべての幹細胞ベースの治療を監視するために重要です。標識された幹細胞のin vivo動態ののより良い理解は、のようなMR画像上で可視化、合理的に方法および幹細胞ベースの治療をより効果的に使用する可能性があります。我々は臨床的に適用される造影剤とイメージング技術を使用しているため、私たちの提示プロトコルは、患者のアプリケーションに簡単に翻訳する必要があります。我々の方法の潜在的な臨床応用は、様々な幹細胞のサブタイプまたは遺伝子改変幹細胞だけでなく、幹細胞移植の予後に関する治療効果の評価の生着過程の比較研究が含まれています。結果は、臨床の現場でそれらの幹細胞ベースの治療の評価において、後に関連する臨床試験のデザインで、幹ベースの治療の前臨床評価ですぐに役立つこと、としてください。注目すべきは、私たちのイメージング技術はまた、造血幹細胞や神経幹細胞などの他の幹細胞集団に適用可能である。

<table><tbody><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>ゼラチンをPBSで希釈し、最終濃度を0.1 %にする</td></tr><tr><td>PBS (Ca++ Mg++ free)</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>特性解析済みFBS</td><td>試薬</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (40 &amp;mu;m ナイロン)</td><td>ツール</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>β-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>試薬</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>フェルムキシド (Endorem)</td><td>試薬</td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェルカルボトラン (Resovist&amp;#174;)</td><td>試薬</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mrイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトes細胞とhmscs

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

近年では、幹細胞研究、発生生物学、様々な疾患と再生医療への影響の可能性についてのより良い理解につながっている。生体内で何度も移植された幹細胞を監視する非侵襲的方法は非常に我々の能力のメカニズムを制御する幹細胞の死を理解し、幹細胞の生着を​​向上させる栄養因子とシグナル伝達経路を特定するためにを高めるであろう。 MR画像は、近くに微細な解剖学的分解能を持つ幹細胞のin vivo描写のための効果的なツールであることが証明されています。 MRで幹細胞を検出するためには、細胞が細胞特異的MRの造影剤で標識する必要があります。この目的のために、このような超常磁性酸化鉄粒子（SPIO）のような酸化鉄ナノ粒子は、、のための細胞の検出とその優れた生体適合性のための彼らの高感度で、適用されます。 SPIO粒子は酸化鉄のコアとT2強調MR画像上で減少信号を発生するローカルフィールドの不均一性を、作成することによって、デキストラン、carboxydextranまたは澱粉コート、および関数で構成されています。このプレゼンテーションでは、MRイメージングと標識された細胞の生体内追跡、その後の非侵襲的に臨床的に適用可能なMR造影剤と幹細胞の標識のためのテクニックのデモンストレーションを行います。

新しい幹細胞療法の評価のためにそれはin vivoで注入された細胞を非侵襲的に追跡することが重要です。このビデオでは、生体内でのその後のMRイメージングのための生体内で酸化鉄ベースの造影剤によるヒト間葉や胚性幹細胞を標識する方法を紹介します。

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

近年、幹細胞研究によって、発生生物学やさまざまな疾患への理解が深まり、再生医療における潜在的な影響が明らかになってきています。

Haiku Dal Link博士の研究室へようこそ。新しい幹細胞療法の評価に向けた本プロジェクトに資金を提供いただいた、カリフォルニア再生医療研究所に感謝いたします。注入された細胞をin vivoで非侵襲的に追跡することが重要です。これは、MRイメージングまたは光学イメージング用の特異的または多機能な造影剤を用いて、細胞をin vitroで標識することで可能です。このビデオでは、その後のin vivoイメージングに向けて、ヒト間葉系幹細胞およびヒト胚性幹細胞を標識する方法を説明します。こんにちは、私はカリフォルニア大学サンフランシスコ校放射線科、分子・機能イメージングセンターの造影剤研究グループのTobias Henningです。本日は、ペリカルボロンおよびカルボロンを用いたヒト間葉系幹細胞の、およびphemオキシドを用いたヒト胚性幹細胞のin vitro標識の手順について解説します。この手法は、生体内で注入された細胞を局在化させたり、細胞の機能状態に関する情報を得たりする際に有用です。MRI造影剤による細胞標識の手順は、胚性幹細胞と間葉系幹細胞で異なりますが、どちらの手法においても以下のステップが含まれます。まず細胞培養の準備として、細胞を播種し接着させます。次に標識用培地を調製し、単純なインキュベーションによって細胞を標識します。その後、幹細胞をトリプシン処理して遊離した造影剤を洗浄し、標識効率と細胞生存率を評価します。それでは、細胞のラベル化を開始しましょう。まずは、テオカルバトロールを用いた間葉系幹細胞のラベル化から始めます。まず、MRイメージング用のテオカロンおよび酸化鉄ベースの造影剤を用いて、ヒト間葉系幹細胞をラベル化する手法を説明します。まず、ラベル化の手順の18〜24時間前に、細胞をT 75フラスコに播種し、コンフルエンスを80%にします。または、別の培養皿を使用する場合は、翌日に1cm²あたり約10,000個の細胞になるように調整してください。次に、8mLの無血清培地にリザーブストックを30µL添加し、ラベル化用培地を準備します。これで、コンフルエンス80%のT 75フラスコ1本分となり、培地1mLあたり100µgの鉄の濃度に相当します。ここで、培養液を除去し、PBSまたは無血清培地で細胞を1回洗浄します。これは、造影剤に結合して標識効率に影響を与える可能性のある残留血清タンパク質およびその他の培地成分を除去するために行います。標識用培地をフラスコに加え、フラスコをインキュベーターに戻します。2時間後、FCSの最終濃度が20%になるように、FCSを2 ml加えます。これは、細胞に分化を促す刺激を与えず、使い慣れた環境で増殖させるためです。次に、細胞を18時間インキュベートします。翌日、細胞をPBSで洗浄し、遊離した造影剤を取り除くために標準

labeling-hescs-hmscs-with-iron-oxide-nanoparticles-for-non-invasive

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、蛍光色素を持つヒト胚性幹細胞と間葉系幹細胞のラベリングのテクニックを示しています。この手法は、生体内で光学イメージングを、蛍光顕微鏡による病理組織学的相関の移植された幹細胞の追跡に使用することができます。...

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

このビデオでは、我々は、塩化マンガンを持つヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）（MnClラベルの作成方法を示しています...

磁気共鳴イメージングのためのヒト胚性幹細胞のin vitroでラベリングの

プレゼンテーションの目的は、MRイメージングで可視化することができます軟骨欠損におけるマトリックス関連する幹細胞移植を、生成するために高度に再現可能な方法を示すことです。幹細胞は、アガロースと混合のFDA承認されたFerumoxides、、軟骨欠損に移植し、7T...

軟骨欠損のヒト間葉系幹細胞を標識Ferumoxidesの注入

ナノ粒子の細胞の生体内分布を評価するために使用されるバイオイメージングの方法はnanoformulated化合物の治療と診断監視に適用できます。本明細書に記載の方法は、組織学的coregistrationで評価した場合、感度と特異性です。方法論は、げっ歯類から人間のアプリケーションへの翻訳経路を提供しています。...

診断と治療モニタリングのためのナノ材料の登録バイオイメージング

我々は、FDAに承認された、超常磁性酸化鉄（SPIO）、ferumoxytol（Feraheme）で幹細胞を標識して追跡するためのテクニックを説明します。可視化のために磁気共鳴（MR）イメージングを利用したこの細胞のイメージング技術は、患者の成功または失敗した幹細胞のengraftmentsの長期的な監視と診断のための容易にアクセス可能です。...

Ferumoxytol、FDA承認酸化鉄ナノ粒子で幹細胞のラベリング

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

MRIを用いて細胞の追跡は、過去数年間に顕著な注目を集めている。このプロトコルは、フッ素と樹状細胞のラベルを記述する（...

使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁気共鳴イメージング

プロトコルの詳細は、 インビトロ第二高調波発生ナノ粒子でヒト胚性幹細胞を標識するために設けられている。多光子顕微鏡および心臓のクラスタへの分化によるヒトES細胞の研究のための方法論も提示されています。...

回生研究ハーモニックナノ粒子

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

標的細胞送達は、さまざまな生物医学的応用に有用です。...

細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

ここで提示されるのは、外傷性脳損傷のマウスモデルにおける非侵襲的間葉系幹細胞(MSC)の送達および追跡のためのプロトコルである。超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、リアルタイムMRIを用いた鼻腔内送達に続くMSC標識および非侵襲的なインビボ追跡のための磁気共鳴画像(MRI)プローブとして採用されています。...

外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のMRIを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡

学ぶ酸化鉄ナノ粒子を用いたヒト間葉系幹細胞と胚性幹細胞の標識法。MRイメージングによる生体内非侵襲追跡技術を習得し、新規幹細胞治療の評価に応用する方法を解説します。

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

さらに動画を探す