Name: MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-31T21:32:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶ酸化鉄ナノ粒子を用いたヒト間葉系幹細胞と胚性幹細胞の標識法。MRイメージングによる生体内非侵襲追跡技術を習得し、新規幹細胞治療の評価に応用する方法を解説します。

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このプロジェクトは、再生医療のためのカリフォルニア工科大学からレオンJ.タールのSEEDの助成金によってサポートされていました。トビアスヘニングは、ドイツ研究協会（DFG、HE 4578/1-2）から奨学金研究によって資金を供給された。我々は感謝してヒト胚性幹細胞の培養上彼のアドバイスをファニートのMenesesを確認応答したい。

FerucarbotranとhMSCのラベリング これはFerucarbotran、MRイメージングのための酸化鉄ベースの造影剤でヒト間葉系幹細胞を標識するためのテクニックです。 <ol><li>開始するには、プレート18〜24時間、80％の合流点でT75フラスコ中のラベリング手順の前に細胞。別の培養皿を使用する場合、これは1cm 2当たり約10000細胞に等しくなります。 </li><li>翌日、無血清培地8mlをするResovistの30μlを添加してラベリングメディアの準備から始まります。これは100μgのFe / mlの培地の濃度に対応する、80％コンフルエントに一つT75フラスコにラベルを付けます。 </li><li>培地を外し、PBSまたは無血清培地で細胞を1回洗浄する。これは、残留血清タンパク質と造影剤と影響力の標識効率を結合することができるメディアの他の成分を取り除くために行われます。 </li><li>フラスコにラベルメディアを追加し、インキュベーターにフラスコを戻す。 </li><li> 2時間後、20％FCSの最終濃度が達成されるように、FCSの2ミリリットルを追加します。これは、細胞が分化して刺激を受けていないことを保証するために行われますが、代わりに使い慣れた環境で成長しています。 </li><li> 18時間にわたって細胞をインキュベートする。これは最高の一晩に行われます。 </li><li>翌日、PBSで細胞を洗い流した後、それらをいつものようにトリプシン処理。 </li><li>一度トリプシン、細胞懸濁液は、メディア内の残留、フリー造影剤を取り除くために3回洗浄する必要があります。これは、PBSで5分間で400 rcfで、細胞を遠心分離することで行われます。 </li><li>最終的に細胞ペレットを再懸濁し、さらなる実験のために準備ができます。 </li><li>一部は前の洗浄ステップの間に失われた可能性があるとして、現在のセルを数える。また、トリパンブルー排除アッセイを使用して、この時点で実行可能性のテストを実行し、標識効率を測定する分光分析のためにいくつかのサンプルを取る。 </li></ol> Ferumoxidesでヒト胚性幹細胞の標識 <ol><li>開始するには、プレート10cmの皿でヒトES細胞、いつものように。これらの料理は、ゼラチンをプレコートされ、それらの上に照射したフィーダー細胞を持っている。あなたにもフィーダーフリーの培養のためにこのプロトコルを使用することができます。 </li><li>彼らは中規模のコロニーを形成するようにヒトES細胞をアタッチし、約3-4日間に成長しましょう​​。この時間の間に、コロニーが大きいコロニーは後で分割することがより困難であるとして、大規模に成長していないことを確認してください。 </li><li>分化した細胞は、そのコロニーの清浄度に応じて、これらの培養物を汚染することができます、あなたは、解剖によって差別化された文化を取り除くために必要があります。 </li><li> 100μg/mlと完全なhESCのメディアの濃度でFerumoxidesから成るラベル、メディアを準備します。このため、我々は、89μlFerumoxidesと完全増殖培地10mlを混ぜる。 </li><li>完全なメディアで一度皿を洗ってください。 </li><li>皿あたりのメディアのラベル付けの10 mlを添加し、4時間細胞をインキュベートする。 </li><li>今、ラベルは完了です。次のステップでは、細胞を洗浄し、さらに使用するために、単一の細胞懸濁液を得ることが必要です。この場合、最初のPBSで皿を洗う。 </li><li>その後、0.25％トリプシン5mlのでPBSを交換し、5分間インキュベーター内でインキュベートする、または細胞がデタッチされるまで。それは頻繁に料理をタップするのに役立ちます。 </li><li>セルは切り離されている。料理は大きなコロニーが含まれていると残って塊があるかもしれないことに留意してください。 </li><li>これらの塊を取り除くために、いずれかの血清学的ピペットを使用して一度全部停止を混在させることができる、それは別の2分間放置します。 </li><li>我々は、細胞膜を破ることができる細いチップを通して、細胞のように繰り返し吸引をエッペンドルフピペットを使用しないでください。 </li><li>残留塊が存在する場合、一つは40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を実行することができます。 </li><li>すべてが正しく機能する場合、単一の細胞懸濁液はゼラチンコーティング、ESC -行列と死細胞に由来する、破片の多くと混合されている存在。このを取り除くために、5分間、400 rcfで、それらをスピンダウンして細胞を2回洗浄し、完全なメディアで再懸濁します。 </li><li>今、ESCは照射フィーダー細胞から分離する必要があります。これは、ゼラチンコートしたディッシュに細胞懸濁液をめっきすることによって効率的に行うことができます。 </li><li>料理が操作されていない場合は、すべての細胞が堆積物下になりますが、フィーダーはESCより速くアタッチされます。 </li><li>フィーダは主に料理に添付する必要がある一方そう、上清を45分後に撮影されている場合、それは、主にESCが含まれている必要があります。 </li><li>この方法では、さらなる実験のために使用することができる磁気標識されたヒト胚性幹細胞の単一細胞の懸濁液が得られる。 </li><li>以前のプロトコルと同様に、この時点では、セルをカウントし、ラベリング効率の実現可能性評価と測定用サンプルを採取する必要があります。 </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+MR+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents.</a> 228, 760-767 (2003).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+iron+oxide+labeled+human+hematopoietic+progenitor+cells+in+a+xenotransplant+model%3A+in+vivo+monitoring+using+clinical+magnetic+resonance+imaging+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment.</a> Radiology. 234, 197-205 (2005).</li>
<li>Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+with+the+positive+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Gadofluorine+M.+Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell labeling with the positive MR contrast agent.</a> Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).</li>
</ol>

幹細胞の非侵襲的な描写は、ほぼすべての幹細胞ベースの治療を監視するために重要です。標識された幹細胞のin vivo動態ののより良い理解は、のようなMR画像上で可視化、合理的に方法および幹細胞ベースの治療をより効果的に使用する可能性があります。我々は臨床的に適用される造影剤とイメージング技術を使用しているため、私たちの提示プロトコルは、患者のアプリケーションに簡単に翻訳する必要があります。我々の方法の潜在的な臨床応用は、様々な幹細胞のサブタイプまたは遺伝子改変幹細胞だけでなく、幹細胞移植の予後に関する治療効果の評価の生着過程の比較研究が含まれています。結果は、臨床の現場でそれらの幹細胞ベースの治療の評価において、後に関連する臨床試験のデザインで、幹ベースの治療の前臨床評価ですぐに役立つこと、としてください。注目すべきは、私たちのイメージング技術はまた、造血幹細胞や神経幹細胞などの他の幹細胞集団に適用可能である。

<table><tbody><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>ゼラチンをPBSで希釈し、最終濃度を0.1 %にする</td></tr><tr><td>PBS (Ca++ Mg++ free)</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>特性解析済みFBS</td><td>試薬</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (40 &amp;mu;m ナイロン)</td><td>ツール</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>β-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>試薬</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>フェルムキシド (Endorem)</td><td>試薬</td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェルカルボトラン (Resovist&amp;#174;)</td><td>試薬</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mrイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトes細胞とhmscs

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

近年では、幹細胞研究、発生生物学、様々な疾患と再生医療への影響の可能性についてのより良い理解につながっている。生体内で何度も移植された幹細胞を監視する非侵襲的方法は非常に我々の能力のメカニズムを制御する幹細胞の死を理解し、幹細胞の生着を​​向上させる栄養因子とシグナル伝達経路を特定するためにを高めるであろう。 MR画像は、近くに微細な解剖学的分解能を持つ幹細胞のin vivo描写のための効果的なツールであることが証明されています。 MRで幹細胞を検出するためには、細胞が細胞特異的MRの造影剤で標識する必要があります。この目的のために、このような超常磁性酸化鉄粒子（SPIO）のような酸化鉄ナノ粒子は、、のための細胞の検出とその優れた生体適合性のための彼らの高感度で、適用されます。 SPIO粒子は酸化鉄のコアとT2強調MR画像上で減少信号を発生するローカルフィールドの不均一性を、作成することによって、デキストラン、carboxydextranまたは澱粉コート、および関数で構成されています。このプレゼンテーションでは、MRイメージングと標識された細胞の生体内追跡、その後の非侵襲的に臨床的に適用可能なMR造影剤と幹細胞の標識のためのテクニックのデモンストレーションを行います。

新しい幹細胞療法の評価のためにそれはin vivoで注入された細胞を非侵襲的に追跡することが重要です。このビデオでは、生体内でのその後のMRイメージングのための生体内で酸化鉄ベースの造影剤によるヒト間葉や胚性幹細胞を標識する方法を紹介します。

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

近年、幹細胞研究によって、発生生物学やさまざまな疾患への理解が深まり、再生医療における潜在的な影響が明らかになってきています。

Haiku Dal Link博士の研究室へようこそ。新しい幹細胞療法の評価に向けた本プロジェクトに資金を提供いただいた、カリフォルニア再生医療研究所に感謝いたします。注入された細胞をin vivoで非侵襲的に追跡することが重要です。これは、MRイメージングまたは光学イメージング用の特異的または多機能な造影剤を用いて、細胞をin vitroで標識することで可能です。このビデオでは、その後のin vivoイメージングに向けて、ヒト間葉系幹細胞およびヒト胚性幹細胞を標識する方法を説明します。こんにちは、私はカリフォルニア大学サンフランシスコ校放射線科、分子・機能イメージングセンターの造影剤研究グループのTobias Henningです。本日は、ペリカルボロンおよびカルボロンを用いたヒト間葉系幹細胞の、およびphemオキシドを用いたヒト胚性幹細胞のin vitro標識の手順について解説します。この手法は、生体内で注入された細胞を局在化させたり、細胞の機能状態に関する情報を得たりする際に有用です。MRI造影剤による細胞標識の手順は、胚性幹細胞と間葉系幹細胞で異なりますが、どちらの手法においても以下のステップが含まれます。まず細胞培養の準備として、細胞を播種し接着させます。次に標識用培地を調製し、単純なインキュベーションによって細胞を標識します。その後、幹細胞をトリプシン処理して遊離した造影剤を洗浄し、標識効率と細胞生存率を評価します。それでは、細胞のラベル化を開始しましょう。まずは、テオカルバトロールを用いた間葉系幹細胞のラベル化から始めます。まず、MRイメージング用のテオカロンおよび酸化鉄ベースの造影剤を用いて、ヒト間葉系幹細胞をラベル化する手法を説明します。まず、ラベル化の手順の18〜24時間前に、細胞をT 75フラスコに播種し、コンフルエンスを80%にします。または、別の培養皿を使用する場合は、翌日に1cm²あたり約10,000個の細胞になるように調整してください。次に、8mLの無血清培地にリザーブストックを30µL添加し、ラベル化用培地を準備します。これで、コンフルエンス80%のT 75フラスコ1本分となり、培地1mLあたり100µgの鉄の濃度に相当します。ここで、培養液を除去し、PBSまたは無血清培地で細胞を1回洗浄します。これは、造影剤に結合して標識効率に影響を与える可能性のある残留血清タンパク質およびその他の培地成分を除去するために行います。標識用培地をフラスコに加え、フラスコをインキュベーターに戻します。2時間後、FCSの最終濃度が20%になるように、FCSを2 ml加えます。これは、細胞に分化を促す刺激を与えず、使い慣れた環境で増殖させるためです。次に、細胞を18時間インキュベートします。翌日、細胞をPBSで洗浄し、遊離した造影剤を取り除くために標準的な培養プロトコルに従って洗浄します。トリプシン処理後、細胞懸濁液を400 RCFで5分間遠心分離し、PBSで再懸濁することを3回繰り返して洗浄します。これで完了です。最終的な細胞ペレットを再懸濁すれば、以降の実験に使用できます。前回の洗浄ステップで一部の細胞が失われた可能性があるため、ここで細胞数をカウントします。また、この時点でトリパンブルー排除法を用いて生存率試験を行い、ラベル化効率を測定するために分光分析用のサンプルをいくつか採取します。それでは、ヒト胚性幹細胞をphem oxideでラベルする方法を説明します。まず、ヒト胚性幹細胞を10 cmディッシュに播種します。通常、これらのディッシュにはあらかじめゼラチンがコートされており、照射済みのフィーダー細胞が存在します。このプロトコールは、フィーダーフリー培養にも適用可能です。ヒト胚性幹細胞を約3〜4日間付着・増殖させ、中程度の大きさのコロニーを形成させます。この間、コロニーが大きくなりすぎないように管理します。これは、コロニーが大きくなると分散させることが困難になるためです。また、後になって分化細胞がこれらの培養物に混入する可能性があります。コロニーの純度に応じて、分化した培養物を解離によって除去する必要がある場合があります。次に、100 µg iron/mLの濃度の鉄酸化物と、完全ヒト胚性幹細胞培地からなる標識培地を調製します。このため、89 µLの鉄酸化物と10 mLの完全増殖培地を混合します。間葉系幹細胞については、死細胞やデブリを除去するため、ディッシュを完全培地で1回洗浄します。次に、1ディッシュあたり10 millilitersのラベル化培地を加え、細胞を4時間インキュベートします。これでラベル化が完了します。次のステップでは、細胞を洗浄し、単一細胞懸濁液を調製する必要があります。そのために、まずディッシュをPBSで洗浄します。次に、PBSを5 mLの0.25%trypsinに置換し、インキュベーター内で5分間、または細胞が剥離するまでインキュベートします。細胞が剥離したところで、ディッシュを頻繁に軽く叩くことが有効です。ディッシュに大きなコロニーが含まれていた場合、凝集塊が残っている可能性があることに注意してください。これらの凝集塊を取り除くため、セロロジカルピペットを用いて懸濁液全体をピペッティングで十分に混合し、その後さらに2分間静置します。トリプシンを用いて処理します。エッペンドルフピペットは使用しません。なぜなら、細いチップで細胞を繰り返しピぺッティングすると、適切に処理されていたとしても細胞膜が破壊される可能性があるためです。これで、胚性幹細胞マトリックスをコーティングしていたゼラチン由来の多くのデブリや死細胞が混在した単一細胞懸濁液が完成しました。40 µmのセルストレーナーに細胞を通すことで、残っている凝集塊や複合体を除去できます。次に、照射したフィーダー細胞からヒト胚性幹細胞を分離する必要があります。これは、細胞懸濁液をゼラチンコートしたディッシュに播種することで効率的に行うことができます。ディッシュを操作しないままであれば、すべての細胞が沈降しますが、フィーダー細胞はヒト胚性幹細胞よりも速く接着します。したがって、45分後にSUP natinを除去すれば、そこには主にヒト胚性幹細胞が含まれており、一方でフィーダー細胞の大部分はディッシュに接着しているはずです。これにより、前述のプロトコルと同様に、その後の実験に使用可能な、磁気標識されたヒト胚性幹細胞の単一細胞懸濁液を得ることができます。ここで、細胞数をカウントし、生存率の評価および標識効率の測定のためのサンプルを採取する必要があります。これで、本日お見せしたいプロトコルはすべて終了です。それでは、標識した幹細胞をin vivoでどのように追跡できるかについて見ていきましょう。このスライドは、OC Caroneで標識された幹細胞を示しています。これらの細胞をマウスの脳に注入するため、20,000個の細胞を75 nanolitersの容量で再懸濁し、脳室下帯に注入しました。移植された細胞に含まれる酸化鉄は、MR画像で確認できる磁化率アーチファクトを引き起こします。胚性幹細胞および間葉系幹細胞のラベル化方法について説明しました。Mr.Contrast剤を用いたin vitroでのラベル化と、in vivoでの間葉系幹細胞および胚性幹細胞のトラッキングは、新しい幹細胞療法の評価において絶大な可能性を秘めています。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。細胞標識の成功を願っております。

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Research

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外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のMRIを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡

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