Chromobacterium violaceumにおけるビオラセインの定量と生理活性化合物による阻害

私たちの研究は、主要な表現型を調節するクオラムセンシングを阻害する化合物を特定することを目的としています。このプロトコルは、細菌の増殖に影響を与えることなくビオラセイン産生を減少させる分子をスクリーニングし、クオラムセンシング干渉を示唆しています。最近の研究では、細菌の増殖に影響を与えることなくクオラムセンシングを阻害する新しい生理活性化合物が同定され、抗生物質耐性菌に対する抗病原剤としての可能性が強化されています。

主な課題には、化合物が成長や形質に影響を与える可能性があるため、クオラムセンシング阻害の特異性が含まれます。このプロトコルでは、尊重と溶解度の影響バランス定量化と呼ばれる、慎重な取り扱いが必要です。細菌の増殖に影響を与えないサブ阻害濃度の生理活性化合物に使用されるプロトコルを確立しました。

これは、抗菌研究とは異なるクオラムセンシングシグナル伝達を開始するための重要な前提です。私たちは、特に食品と健康に関連する細菌における新しいクオラム状態阻害剤の同定とコミュニケーション阻害メカニズムの解明に焦点を当てます。まず、クロモバクテリウム・ビオラセウムATCC 12472をルリア・ベルタニまたはLBブロスで5ミリリットル培養します。

毎分220回転に設定された振とうインキュベーターで摂氏30度で培養物を24時間インキュベートします。オーバーナイト培養の光学密度を測定し、それを1ミリリットルあたり8コロニー形成単位の約1×10に調整します。LBスープを使用。

化合物を調製する場合は、生理活性化合物を秤量し、溶解度に応じて純粋なDMSOまたはDMSOと水の1対1の混合物で希釈します。平底の96ウェルプレートを取り、連続希釈スキームに従ってLBブロスと生理活性化合物を加えます。各ウェル内の所望の濃度に必要な原液の量を計算するには、式を適用します。

各穀物希釈セットの最初の列。196マイクロリットルのルリアベルタニブロスを3列目、5列目、7列に加えます。次に、希釈に使用する後続のカラムで、100マイクロリットルのルリアベルタニブロスを4、6、および8番目の列に加えます。

連続希釈を開始するには、4マイクロリットルの生理活性化合物を各セットの最初のウェル(列3、5、および7)に加えます。混合後、各ウェルから隣接するカラムに100マイクロリットルを移します。連続希釈を続行して、列 4、6、および 8 に達します。

クロスコンタミネーションを避けるために、新しいチップを使用して、すべての化合物の濃度ごとに手順全体を3回繰り返します。80マイクロリットルのルリアベルタニブロスを、すべてのウェルのB列からDに追加します。ウェルあたり合計180マイクロリットルになります。

次に、前の調製物から標準化されたクロモバクテリウム・ビオラセウム培養物を20マイクロリットルをこれらのウェルのそれぞれに加え、最終容量200マイクロリットルに達します。分光光度計の互換性に基づいています。蒸発を防ぐために、マイクロプレートを蓋またはシールフィルムで覆います。

密封されたプレートを摂氏30度で、毎分130回転で攪拌しながら24時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを摂氏60度に設定された乾燥インキュベーターに移します。蓋を外し、約8時間完全に乾かします。

乾燥したら、インキュベーターからプレートを取り出し、各ウェルに200マイクロリットルの純粋なDMSOを加えます。プレートを覆い、毎分130回転で振とうしながら摂氏25度で30分間インキュベートし、ビオラセイン色素を溶解します。インキュベーション後、溶解したビオラセイン溶液100マイクロリットルを新しいマイクロプレートに慎重に移します。

ピペットチップとウェル壁との接触を避けます。汚染を避けるために、蓋をしたマイクロプレート分光光度計で595ナノメートルのビオラセインの吸光度を測定します。各読み取りの前に5秒間振って、汚染を避けるために蓋をした状態で読み取りを実行します。

ビオラセイン産生量を計算するには、まず各サンプルからブランクの吸光度を差し引いてバックグラウンド干渉を排除し、次に未処理のコントロールを方程式の基準として使用してビオラセインのパーセンテージを計算します。3つの生理活性化合物、レスベラトロール、ファルネゾール、およびリナロールが、クロモバクテリウム・ビオラセウムATCC 12472におけるビオラセイン産生を阻害する能力についてテストされました。ファルネゾールは、未処理の対照では100%と比較して、ビオラセイン産生を200マイクログラム/ミリリットルで9%、100マイクログラム/ミリリットルで19%に有意に減少させました。

200マイクログラムと100マイクログラム/ミリリットルの両方でリナロール処理を行うと、ビオラセインが32%生成され、対照と比較して68%の阻害が示されました。レスベラトロールは、15マイクログラム/ミリリットルで、ビオラセイン産生を15%に減少させましたが、12マイクログラム/ミリリットルでは、30%に達しました。マイクロプレート画像は、未処理の対照と比較して、すべての治療でビオラセイン色素沈着の減少を視覚的に確認しました。