マルチモーダル広視野フーリエ変換ラマン顕微鏡

私たちは、画像の各ピクセルからラマンまたは光発光スペクトルを取得するマルチモーダルハイパースペクトル顕微鏡を開発し、測定時間を短縮しました。従来のラスタスケーリング手法は分散分光器に依存しています。高度な技術は、共鳴時の光や分子振動を駆動する同期した短レーザーパルスを用いてラマン信号を増強します。

下部ラマン散乱断面は主に2つの課題を抱えています。まず、弱い信号で、長い取得時間が必要です。第二に、ラマン信号は強い光発光背景によって圧倒されることがあります。

フーリエ変換分光法は、すべてのピクセルにわたる並列スペクトル取得を可能にし、より高速な測定を可能にし、弱いラマンピークを強い発光背景から分離するなど、特定のスペクトル情報にアクセスするための調整可能なサンプリングを可能にします。フーリエ変換アプローチは、時間的痕跡の情報を活用したスマートサンプリングとデータ解析を可能にします。私たちは、獲得時間をさらに短縮するために、アンダーサンプリング戦略をカスタマイズすることを目指しています。

まず、スクレーパーを使って1粒の顔料粉を20ミリグラムずつ精密な天秤に注ぎ、1対1の重さ比率を得ます。粉末を乳鉢で混ぜて塊を取り除きます。できた混合物を顕微鏡スライドに注ぎます。

その後、スクレーパーの先端で優しく押し、ほぼ均一な厚さの層を作ります。顕微鏡カバーの縁にネイルポリッシュを塗ります。ネイルポリッシュを下向きにして混合物の上に置き、密閉するほどの圧力をかけます。

次に励起波長を設定し、励起レーザーを大型コアマルチモードファイバーの入力に集束します。顕微鏡ステージにテストサンプルを置き、カメラをオンにしてレーザー照射されたスポットを観察します。ファイバーの中央部分をボイスコイルの振動膜に取り付けると、スペックルが除去されます。

繊維をきつく曲げて機械的にスクランブルし、すべての空間モードを融合させます。532ナノメートル、帯域幅2.0ナノメートルの狭帯域フィルターを挿入し、レーザーラインをクリーンにし、不要なポンプスペクトルサイドバンドを除去します。二色性ミラーを使ってレーザー光を試料に反射させ、対物レンズが集めた赤方偏移後方散乱放射を透過します。

残留照明を除去するために532ナノメートルのロングパスフィルターを挿入します。試料面のパワーメーターでパワーを測定します。損傷につながらない強度を得るためにポンプビームを調整してください。

次に、サンプルを顕微鏡ステージに置いて焦点を調整します。ウェッジの移動を行うモーターのドライバーをオンにし、取得オプションを押します。その後、カメラの取得パラメータ(タイムフレームやハードウェアのビニング)を設定し、信号強度を最適化します。

次に、ステップの長さ、ホームポジション、ステップ数を設定します。ディレクトリ名とファイル名を追加してください。クロスポイントをターゲット位置に移動し、「測定」をクリックすると、各くさび位置ごとにモノクロ画像の取得を開始します。

測定が終わったら、データ解析の前にレーザーを切ります。次に、ステッピングモーター専用のモーター位置補正ファイルと干渉計対応の周波数校正ファイルを読み込み、取得したデータセットからスペクトルハイパーキューブを生成します。スペクトルの波長をフーリエで計算し、すべてのピクセルの干渉図を変換します。

ハップ・ゲンツェル窓のように、スペクトル拡大とアーティファクト削減の良いトレードオフを提供するアポダイゼーション関数を適用します。次にスペクトルハイパーキューブを生成し、複素値で保存します。解析ソフトを起動し、複素値のスペクトルハイパーキューブを開いてください。

偽色RGB画像を作成し、選択領域の平均スペクトルを取得してスペクトルハイパーキューブを解析します。同じ視野角でのラマン測定では、検出経路にバンドパスフィルターを追加します。タイムフレームとハードウェアのビンニングを設定し、その後設定の長さ、ホーム位置、ステップ数を設定します。

Measureを押す前に、保存するファイル名とディレクトリを選択してください。ラマンスペクトルの特徴により、ルタルは454センチと616センチメートル、アナターゼは396、514、641センチメートルで特徴的なピークが、カドミウムイエローは301および605センチメートルで、視野内で明確に区別されます。一方、フォトルミネッセンスマップでは、カドミウムイエローだけが視野全体に分布し、強い放射が画像全体を支配しています。

実際、ルチルとアナターゼからの微かな欠陥放出は、黄色い粉末とスペクトル的に区別できません。