神経毒性のリードアウトとしての Drosophila melanogaster の自発運動機能障害の行動解析

私たちの研究の目標は、神経毒性化合物のスクリーニングのための費用対効果が高く、倫理的に有利な方法を開発することです。毒物学検査の従来の方法は、多くの場合、仮想レートモデルに依存していますが、これは高価で時間がかかり、それ以外は倫理的な懸念があります。私たちは、高感度でスケーラブルなショウジョウバエの代替モデルを使用して、神経毒性の初期兆候を検出できるかどうかを調査したいと考えました。このプロトコルは、運動パターンの変化や活動性などの行動表現型だけでなく、進行性の運動機能低下やセキュリティの書き込み中断などの行動表現型を検出するのに役立ち、幅広い好みもテストされます。

私たちのプロトコルの利点は、古典的なクライミングアッセイとリアルタイムモニタリング技術を組み合わせることであり、これにより見逃される可能性のある微妙な運動障害を捉えることができます。従来の方法により、より高い感度とより正確な行動データを提供します。

[ナレーター]まず、ハエを空のボトルにそっと移します。ハエの入ったボトルを氷で満たされた箱の中に入れ、ボトル全体が覆われていることを確認します。1分後、ボトルを軽くたたいて、すべてのハエが麻酔されていることを確認します。氷を入れた小さな容器を用意します。氷の上にペトリ皿または平らで清潔な面を置き、冷やしたプラットフォームを作成します。次に、冷やしたペトリ皿の上にチューブをひっくり返し、軽くたたいてハエを冷たい表面に放します。ハエを空のバイアルに慎重に移します。ハエが摂氏25度の制御された環境で30分間麻酔から回復し、12時間の明暗サイクル、湿度50%にします。次に、マイクロキャピラリーフィードの調製では、ピペットを使用して 10 マイクロリットルの試験溶液を各マイクロキャピラリー チューブに手動でロードし、すべてのサンプルで一定の量を確保します。実験中の蒸発や漏れを防ぐために、各マイクロキャピラリーチューブの開口端に3〜5マイクロリットルの鉱物油を追加します。プレフィルドされたマイクロキャピラリーを綿バイアルプラグの穴に挿入し、しっかりとフィットするようにします。ハエの入ったバイアルを摂氏25度に設定したインキュベーターに12時間の明暗サイクルで入れ、実験中はバイアルをインキュベーターに置いたままにします。12時間ごとに、ハエを清潔な空のバイアルに移して、自発運動活動を評価します。油性マーカーを使用して、バイアルの底から7センチメートルの線を測定し、マークします。このマークが登山のターゲットとなります。カメラや携帯電話を安定した場所に配置して、登山行動を記録します。明確な視認性と分析を可能にするために、適切な照明と透明な背景を確保します。実験セットアップがカメラの視野と互換性があることを確認し、録画を開始します。ビデオ録画を確認し、各ハエが 7 センチメートルのマークに到達するまでにかかる時間を測定します。前に示したように、サンプルと鉱物油シールを使用して供給マイクロキャピラリーを準備します。次に、長さ約6センチメートルにカットされた透明なプラスチックストローを使用して、個々の移動チャンバーを準備します。各ストローの一端を透明なフィルムで密封して、気密性を確保します。ストローの密閉された端の近くに、供給マイクロキャピラリーを挿入するための小さな穴を開け、ぴったりとフィットし、アッセイ中に漏れたり動かしたりしないようにします。先に示したようにハエを麻酔して分離した後、細い絵の具ブラシを使用して、麻酔をかけたハエを 1 本ずつ各チューブにそっと入れます。各チューブの開いた端を透明フィルムまたは綿プラグで密閉し、空気の流れを確保しながら漏れを防ぎます。次に、指定された穴から準備された各チャンバーに事前に充填されたマイクロキャピラリーを挿入します。組み立てたチューブをアッセイアリーナに配置し、マイクロキャピラリーが毎日交換できるようにアクセスできるようにします。セットアップ全体を、摂氏25度に維持され、12時間の明暗サイクルと50%の湿度でチャンバー内に配置します。デバイスをローカル追跡システムまたはネットワークに接続します。ソフトウェアプラットフォームにアクセスし、実験に割り当てられたデバイスを見つけます。システムが視覚的なマーカーに基づいて各ハエを正しく追跡していることを確認します。すべての実験メタデータを入力し、アッセイの記録を開始します。24 時間と 48 時間で負の走位性アッセイを使用して評価された登山能力は、24 時間で対照群と治療群の間で同様のパフォーマンスを示し、即時の運動障害がないことを示しています。48時間までに、治療されたハエは、重大な運動障害を反映して、対照と比較して登るのにほぼ2倍の時間がかかります。継続的な活動追跡により、治療を受けたハエは最初は動きが亢進しましたが、12時間後に活動が急激に低下し、初期の過興奮とそれに続く運動機能の低下を示唆していることが明らかになりました。24〜40時間までに、処理されたハエは対照と比較して動きが減少します。全体として、処理されたハエは、40時間で活動が約20%減少します。 治療されたハエは、最初は光の合図に遅れて反応し、その後一時的な概日調整が続きましたが、おそらく機関車の不足の結果として、48時間までに徐々にリズミニスを失いました。処理されたハエは、対照よりもライトゾーンを好みます。