インビトロ Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles(GUV)内部の細胞骨格ネットワークの再構成

私たちの研究は、天然の細胞膜の構造と挙動を厳密に模倣する膜の設計に焦点を当て、最小限の合成細胞が主要な生物学的機能を複製できるかどうかを調査しています。

相分離小胞を作成し、これらのマイクロキャリアをさまざまな用途に使用するために、さまざまな技術が採用されています。たとえば、技術は二重層cDICEと電鋳です。大きな課題の1つは、膜小胞上で相分離を発生させながらタンパク質の機能を維持することです。温度を上げると、タンパク質やその他の生体分子が不安定になる可能性があります。

[ナレーター]まず、ビオチン化脂質混合物と非ビオチン化脂質混合物のバイアルを入手します。各32ミリモル脂質混合物の50マイクロリットルをクロロホルムに溶解します。次に、2つのガラスバイアルに入れて窒素ガス流下で約15分間乾燥させます。ガラスバイアルをデシケーターに入れます。残留クロロホルムを除去するために、真空下で約30分間保管します。次に、乾燥した脂質膜を 20 マイクロリットルのデカンと 500 マイクロリットルの鉱物油の混合物に同じバイアルに分散させ、最終的な脂質濃度を 3.2 ミリモルにします。バス超音波処理器を使用して、2つの混合物を摂氏約50度で30分間超音波処理します。次に、脂質と油の混合物を2本のチューブに移します。混合物がインキュベートされている間に、タンパク質用の内部カプセル化混合物を準備します。FtsZタンパク質混合物を調製するには、リストされた試薬をチューブ内の最終容量10マイクロリットルに加えます。使用するまで混合物を氷の上に置いてください。アクチン束のカプセル化のために、まず、86%のG-アクチン、10%のATTO 488アクチン、および4%のビオチン化アクチンを含む10マイクロリットルのアクチンマスターミックスを水中で調製します。ミックスを氷の上に置き、光から保護します。使用直前に、ヨウジキサノール、水、NeutrAvidin、BSA、Ficoll 70、10xアクチン重合バッファー、A-Mix、ファシン、ATPを順番に加えて、最終アクチン溶液を調製します。よく混ぜ、カプセル化に5マイクロリットルを使用します。FtsZをカプセル化するには、500マイクロリットルのFtsZ反応バッファーを1.5ミリリットルのプラスチックチューブにピペットで入れます。200マイクロリットルの脂質と油の混合物をそっと加えて、油と水の界面を形成します。2番目のチューブに、200マイクロリットルの脂質と油の混合物を加えます。このチューブを摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、5マイクロリットルのFtsZタンパク質混合物をインキュベートした脂質と油のチューブにピペットで入れ、液滴として沈めます。溶液が濁るまでチューブを5〜6回軽くたたいて、エマルジョンを形成します。このエマルジョンを、先ほど準備した油水界面の上に慎重にピペットで入れます。次に、サンプルを6,000 gで摂氏37度で30分間遠心分離します。サンプルを室温まで30分間冷却します。次に、ピペットを使用して上部の油層をそっと取り除き、イメージング用に100〜200マイクロリットルの溶液を残します。ピペットチップを斜めにカットします。チューブの底から50〜100マイクロリットルのGUV溶液を取り出すために使用します。アクチンを96ウェルプレートに直接カプセル化するには、198マイクロリットルの2モルグルコースと802マイクロリットルの水を組み合わせて、内部アクチンミックスの浸透圧に一致する外部グルコース溶液を調製します。100マイクロリットルの10グラム/リットルのBSAをウェルに加えることにより、96ウェルプレートのウェルを不動態化します。10〜15分間のインキュベーション後、ウェルを100マイクロリットルの外側溶液で5回洗浄します。最終洗浄液を100マイクロリットル残します。次に、ピペットを側壁に置き、50マイクロリットルの脂質と油の混合物をウェルにそっと加え、外側の溶液の上に正しく層状に配置します。別のチューブに、100マイクロリットルの脂質を油に加え、インキュベートします。インキュベートした脂質および油チューブに2.5マイクロリットルの最終アクチン溶液を加え、液滴として沈めます。混合物が濁るまで、チューブの底を10〜20回軽くたたきます。界面を壊さずに、ウェル内のオイル単層の中心にエマルジョンをそっとピペットで移します。次に、96ウェルプレートを200gで摂氏37度で20分間遠心分離します。イメージングする前に、プレートを室温まで30分間冷まします。膜が液体無秩序ドメインと液体秩序ドメインに脱混合され、5〜30マイクロメートルのサイズの小胞の高収率を備えた巨大な単層小胞(GUV)が得られました。FtsZネットワークは、GUV内で再現され、GTPおよびFicoll 70の存在下で液体無秩序膜ドメインに優先的に局在しました。アクチンネットワークは、再構成されると、膜に付着する薄い束として現れ、まばらなウェブ状の構造を形成しました。 ビオチン化脂質がなければ、アクチン束は膜に付着せず、代わりに小胞内腔内で硬くてまっすぐなままでした。より高い遠心分離条件下では、アクチンミオシンを含む小胞が生産井戸で充填された組織様構造に凝集しました。