過分極 ¹³C NMRを用いた生細胞のリアルタイム代謝検出

高度な過分極NMR技術を用いて、リアルタイムの血清代謝を測定する非侵襲的な方法を開発しました。私たちの目標は、さまざまな生物学研究アプリケーションのためのアクセス可能なツールを作成することです。血清代謝のためのいくつかの過分極 NMR システムが報告されています。しかし、より広範な研究実施のための標準化された再現性のあるプロトコルは、これまで利用できませんでした。

当社のプロトコルは、市販のコンポーネントを使用してアクセシビリティを強化します。また、システム混合の利点や、より幅広い適応のための反復測定機能など、包括的な検証も提供します。私たちの結果は、気を散らすことなく生細胞の動的な代謝変化をリアルタイムで追跡することを可能にします。これにより、多様な代謝プローブアプリケーションにおける長期薬物研究の新たな可能性が開かれます。

私たちのアプローチには、プロブオプションや自動化要件などの制限があります。課題を解決することで、細胞代謝測定技術が確立され、将来の当研究室のDNP研究の取り組みが豊かになります。

[ナレーター]まず、2ミリリットルの0.25%体積対体積トリプシンEDTA溶液を10センチメートルの皿に加えます。皿を軽く傾けて、表面全体が覆われるようにします。次に、余分なトリプシンエチレンジアミンテトレーチン酸溶液を吸引します。皿を摂氏37度に設定したインキュベーターに入れ、2分間インキュベートします。次に、10ミリリットルの培地を皿に加えます。ピペットを使用して、ゆっくりと上下にピペットで細胞を表面から切り離し、細胞懸濁液全体を15ミリリットルの円錐形のチューブに集めます。次に、約10マイクロリットルの細胞懸濁液を取り、セルカウンターにロードして細胞数を決定します。測定されたカウントで約1,000万個の細胞の収量が確認されていることを確認するか、必要に応じて調整してください。残りの細胞懸濁液を120 x g で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引して廃棄します。得られた細胞ペレットを4ミリリットルの2重量対体積%アルギン酸溶液に再懸濁し、ゆっくりとピペットで気泡の形成を最小限に抑えます。次に、10ミリリットルの50ミリモル塩化カルシウム溶液を50ミリリットルの遠心分離管に加えます。塩化カルシウム溶液の入った遠心分離管のキャップにシリンジを固定します。300マイクロリットルの細胞アルギン酸混合物を、3ゲージの10ミリメートル針を取り付けた0.5ミリリットルの注射器に引き出します。次に、シリンジをキャップに固定して遠心分離管をしっかりと閉じ、アセンブリを遠心分離機に入れて200 x gで5分間穏やかに回転させます。遠心分離後に上清を除去し、得られたゲルを培地に再懸濁します。次に、パスツールピペットを使用して、細胞カプセル化されたゲルをNMRチューブに移し、スポンジ固定具を挿入して密閉性を確保します。体積対体積で5%の重水素を含む培地リザーバーを摂氏37度の水浴で予熱します。状態を安定させるために、毎時約500マイクロリットルの速度で循環を開始します。続行する前に、セットアップを検査して漏れがないことを確認してください。25ミリモルのOX063をドープした14.2モルの濃度で18マイクロリットルの炭素13標識ピルビン酸をサンプルバイアルに加えます。バイアルを動的核偏極偏光子システムの流体経路に接続します。次に、接続されたバイアルを動的核偏光子のボアユニットに挿入します。マイクロ波を約188ギガヘルツで22ミリワットの出力で60〜80分間照射します。動的核分極システムに統合された固体核磁気共鳴分光計を使用して、炭素 13 信号強度を監視します。システム制御ソフトウェアを使用して、5分ごとに信号データを記録します。次に、生物学的温度に予熱した3.2ミリリットルの溶解バッファーに分極したサンプルを急速に溶解します。準備したサンプルをNMRチューブにロードし、チューブを分光計に挿入します。NMRコンソールで、自動手順を開始して、最適なスペクトル分解能と信号の安定性を確保するために、サンプルを所定の位置にロック、調整、マッチング、シミングします。13-CPDなどの設定を使用して、プロトンデカップリングを有効にした炭素13パルス集録シーケンスをロードします。P1としてラベル付けされた1マイクロ秒のパルスでフリップ角度を90度に設定します。次に、取得時間を 1.376 秒、スペクトル幅を 23,663 ヘルツ、取得ポイント (TD) を 65,536 と定義します。緩和遅延D1をゼロ秒に設定します。擬似2次元モードで150のシーケンシャルスペクトルを取得するためにTD1に150の時間刻みを割り当て、過分極サンプルによる信号飽和を回避するために、レシーバゲインを約1などの低い値に調整します。次に、蠕動ポンプを停止して培地の循環を一時的に停止してから、過分極溶液を入口チューブから注入します。 過分極基板を溶解する約10秒前にスペクトル取得を開始し、検出部位に到着したときに信号を確実に捕捉します。溶液が動的核偏光偏光子から出たら、1ミリリットルの溶液をシリンジに引き込みます。バイオリアクター入口の三方弁を位置Bに切り替えて、過分極溶液をNMRチューブに導きます。注入が完了したら、バルブを位置 A に戻して媒体循環を再開し、逆流を防ぎます。最後に、取得ソフトウェアで自由誘導減衰信号の増加に気付いた後、注入が成功したことを確認します。NMR測定のために移送する前に、最終溶液が308〜313ケルビンの温度と約7のpHに達することを確認してください。同じSCCVII細胞カプセル化サンプルの超分極炭素13 NMRスペクトルを1.5時間間隔で取得し、非破壊測定を繰り返す実現可能性を評価しました。最初のNMR測定では、乳酸シグナルが著しく増加し、ピルビン酸から乳酸への代謝変換が活発であることを示しています。その後の 1.5 時間間隔での測定では、乳酸シグナル強度の漸進的な低下が明らかになり、時間の経過とともに代謝活動が低下したことが示されました。HeLa細胞では、初期測定により、ピルビン酸から乳酸への変換が成功し、明確に識別できるシグナルピークが確認されました。T2緩和によりシグナルは徐々に減少しましたが、60秒間の取得を通じてS/N比は適切なままであり、現在のプロトコルが広く適用可能であり、さまざまな細胞型におけるリアルタイム代謝プロファイリングのための汎用性の高いツールとして機能できることを示唆しています。