成熟種子からの絶滅危惧種薬用蘭 Hemipilia cucullata の非共生発芽と葉外植片に基づく再生

ここでは、 Hemipilia cucullataの非共生種子発芽、苗の発育、およびシュート伸長を最適化するためのプロトコルを提示します。このプロトコルはまた、無菌の葉の外植片からの原球茎様体の誘導を可能にし、この絶滅の危機に瀕している薬用蘭の保存と持続可能な使用のための効率的な in vitro 繁殖を促進します。

私の研究は、絶滅危惧種の蘭の組織培養プロトコルを最適化して、これらの貴重な薬用植物の保全、大規模繁殖、持続可能な利用を強化することに焦点を当てています。大きな課題は、蘭の種全体で一貫した発芽率と再生率を達成することであり、それぞれが種固有の培地の最適化と成長条件の正確な制御を必要とするためです。私たちは、複数の絶滅危惧種の植物に対する効率的な組織培養プロトコルを開発し、種の回復を可能にし、自然の生息地への再構築を支援しています。

Hemipilia cucullataの増殖、修復、および保存を処理するための効率的な再現性のある組織培養システムは存在しません。陸生蘭は、多くの場合、分離と識別が複雑な特定の共生菌を必要とします。共生法は伝播を簡素化し、これらの手順をバイパスします。

当社の実用的なものは、高い発芽と成熟状態からの迅速な植物再生を可能にし、真菌への依存を排除し、Hemipilia cucullataの繁殖のためのより迅速で信頼性の高いアプローチを提供します。まず、カプセルをビーカーに入れます。すすぎのためにビーカーに洗剤を1〜2滴加えます。

カプセルを流水道水で5分間洗います。次に、滅菌吸収紙を使用して、カプセルから残りの表面水を取り除きます。次に、カプセルを75%エタノールに30秒間浸します。

カプセルを約50%利用可能な塩素を含む20%次亜塩素酸ナトリウム溶液50ミリリットルに浸して滅菌します。次に、原液の家庭用食器用洗剤を2滴溶液に加え、カプセルを10〜12分間インキュベートします。カプセルを滅菌蒸留水で5回すすぎ、残留消毒剤を取り除きます。

次に、滅菌メスを使用して、カプセルの頂点と小花柄の端の両方から約1ミリメートルを取り除きます。カプセルの上端に小さな切り込みを入れて種子を露出させ、滅菌ペトリ皿に集めます。滅菌鉗子を使用して、調製した培地を含む各培養ボトルに約500〜600個の種子を均一に分散させます。

種子が水を吸収し、液体培地の底に沈殿させます。培養物を摂氏25度に維持し、明暗サイクル12時間、光強度36マイクロモル/平方メートル/秒。種子の発芽を毎週観察します。

目に見える形態学的変化を記録し、文書化のために培養物を写真に撮ります。芽の伸びのために目に見える黒ずみや完全な黄変のない、サイズが1〜2センチメートルの健康な小苗を選択します。滅菌および冷却された鉗子を使用して、8〜12個の小苗を、新たに調製した芽伸長培地を含む各ボトルに無菌的に移します。

各ボトル内に小苗を均等に分散させます。5週間の新芽伸長後、完全に発達した新芽と健康な葉を持つ小苗を選択して、葉の外植片サンプリングを行います。滅菌メスを使用して、健康な小株から完全に膨張した無菌の葉を切除します。

頂端領域と葉の縁を取り除きます。次に、無菌条件下で滅菌メスを使用して、各葉を約0.5 x 0.5センチメートルのセグメントに切ります。10個の葉セグメントを、近軸面を上に向けてPLB誘導媒体に置きます。

各セグメントが媒体にしっかりと触れていることを確認してください。その後、5週間培養します。最後に、誘導に成功したPLBの数を評価し、誘導率をパーセンテージで計算します。

平均芽の高さをセンチメートル単位で記録し、外植片ごとに形成された芽の数を数えます。液体培地中の種子発芽は、約60日で種皮から緑色の胚が出現し、その後80〜85日で球形の原球茎が形成されることによって目に見えて特徴付けられました。72%の最高の発芽率は、0.5ミリグラム/リットルのNAAを添加した液体培地で達成されました。

ベンジルアデニン/リットルあたり0.5ミリグラム、NAAあたり0.2ミリグラムを含むB5培地は、外植片あたり平均5.3個の新しく形成された原球体と、最高の原球菌増殖率をもたらしました。最適化された成長調節剤の組み合わせでB5培地で培養したプロトコームは、同じ条件下でMS培地で増殖したものよりも活発な成長と健康な緑色の色素沈着を示しました。平均4つの小株あたりの枝の数が最も多かったのは、各ベンジルアデニンとNAAが1リットルあたり1ミリグラムで観察され、僅差でNAAのみが1リットルあたり0.5ミリグラムでした。

シュートの伸びは、ベンジルアデニン 1 リットルあたり 0.5 ミリグラムと NAA 1 ミリグラムの組み合わせで最も強化され、平均苗高は 4.8 センチメートルになりました。原球茎様体の最高の誘導率 44.3% は、1 リットルあたり 3 ミリグラムのベンジルアデニンと 0.2 ミリグラム/リットルの NAA を使用して達成されました。