シロイヌナズナにおける男性減数分裂前期中のセントロメア運動のライブイメージング特性評価

私たちの研究は植物減数分裂を探求し、減数分裂進行中の相同染色体の認識、アライメント、ペアリングを導く分子メカニズムを明らかにすることを目指しています。減数分裂プロファイルにおける染色体の動きを可視化することが課題であり、軌跡を追跡するために高解像度かつ高速な生きた組織画像が必要です。まず、スペーサーの片側の保護フィルムを剥がし、ガラススライドの中央に置きます。

次に2枚目の保護フィルムを外します。スペーサーの中央に8マイクロリットルの水道水を注ぎます。ピンセットを使って、主茎の一つから花序を摘み取ります。

花序を新しいスライドの上に置き、定規付きの立体顕微鏡の下に置きます。長さ約0.5ミリメートルの花蕾を選びます。鋭い針を使い、萼片や花弁を引き裂いて花葯だけを残して優しく芽を開けます。

萼片や花びらを取り除いた後、脱水を防ぐために花董の房をスペーサー腔内の水に慎重に移してください。スペーサーキャビティ内にいくつかの花蝽の房を置きます。スリップでカバースリップを覆い、気泡を避けるために、カバースリップに8マイクロリットルの水を加えます。

次に、水滴をスペーサーキャビティに向けたままカバースリップを慎重に逆さまにします。他の花束を合計16マイクロリットルの水に浸し、カバースリップがスペーサーにしっかり密着するようにしてください。顕微鏡を488ナノメートルで励起させ、494ナノメートルから547ナノメートルのハイブリッド検出器で検出します。

次に明視野照明を使って葯を局所化します。ブライトフィールドチャネルを用いて、細胞の形状に基づいて減数分裂段階を決定します。ソフトウェア上で葯を可視化し、RFP信号を細胞の減数分裂段階の追加指標として使います。

連続取得を行うには、時間区間で時間間隔をゼロに設定します。その後、スポットモジュールを使って自動的にスポットを追跡します。緑色のソースチャネルを選択し、GFPCENH3マークされたセントロメアのXY直径を1マイクロメートルに設定します。

その後、制御ウィンドウの下部にあるグラフを使って信号強度に基づいて検出品質を調整します。オート回帰型モーショントラッキングアルゴリズムを使ってセントロメアの軌跡を追跡し、すべての軌跡を可視化して減数細胞と体細胞組織を簡単に区別できます。次に、スポットモジュールを使って選択した原子核のスポットを時間経過で追跡します。

オプションセグメントを選択し、関心領域のみを選択し、その領域内でスポットトラッキングを行い、関心領域を定義します。原子核が三次元すべて、そして時間をかけて適切に含まれる関心領域を選びます。系譜図では、ソフトウェアの3Dビューアを使ってすべての軌跡を可視化します。

分析された減数子細胞の外側にある軌跡は、選択してキーボードのDeleteキーを押して削除します。編集モードでは、オブジェクトを削除または追加し、正しい平面に追加されます。編集トラックモードでは、セルを3Dで徹底的に解析した後、新しいオブジェクトを手動で系譜図に接続します。

各時間ステップでの瞬時速度を計算し、時間経過による移動速度の変化を監視します。旋回角を連続した時間ステップ間の移動方向の変化として計算し、軌道パターンを明らかにします。結果と瞬時速度を保存してください。

セルトラッカーを使ってアウトリーチ比率を計算し、追跡対象が出発位置に対してどれだけ移動しているかを測定し、探索行動を示します。各トラックの平均速度を計算し、観察期間中の移動特性をまとめます。トラックごとの平均旋回角を計算して、動き、方向性、挙動パターンを分析し、結果を保存します。

次に、各時間ステップでの重心サイズを計算し、中心粒の平均位置周辺の空間的分散を測定します。時間経過による重心の大きさの変化を用いて、セントロメアトラック間の全体的な一貫性を評価し、その結果を保存します。速度の交差相関を計算し、異なる追跡対象の移動力学間の関係を解析し、潜在的な協調的行動を明らかにします。

次に、各トラックの平均二乗変位を計算し、一定期間内でセントロメアが移動する平均平方距離を定量化します。減数分裂中心体は体細胞中心体と比べて平均速度が109.35ナノメートル毎秒と有意に高い速度を示しました。減数分裂中心体は体細胞中心体に比べて分布域が広く、正規化された到達比率が高いことが示されました。

旋回角の分布は減数分裂中心体と体細胞中心体で異なっていました。減数分裂中心体の平均二乗変位は時間とともに増加した一方で、体細胞中心体はほぼ停滞していました。このプロトコルにより、シロイナズナにおける減数分裂染色体移動の初の定量化が可能となり、接合体およびパキテン期における中心体動態の劇的な動態が明らかになりました。

このプロトコルにより、減数分裂前期におけるゲノム領域の動きを研究可能にし、他の植物種への応用にも適応可能です。この研究により染色体移動と組換えの相互作用の探求が可能となり、植物配偶子形成における遺伝的多様性を駆動するメカニズムの理解を深めています。