Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from <em>Escherichia coli</em>

Erik J. Daquilanea; Meredith N. Frazier

doi:10.3791/68577

JoVE Journal
Biochemistry

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Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

大腸菌からの有毒ヌクレアーゼの過剰発現と精製

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08:13 min

August 29, 2025

DOI: 10.3791/68577-v

Erik J. Daquilanea¹, Meredith N. Frazier¹

¹Department of Chemistry and Biochemistry,College of Charleston

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

この記事では、C41(DE3)発現系で毒性ヌクレアーゼである組換えNsp15を過剰発現し、その後、アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタグ付きタンパク質を精製する方法論について説明します。これらのプロトコルは、他の困難な有毒タンパク質にも適応できます。

私たちの研究室は、コロナウイルスを含むニドウイルスに見られる保存されたエンドヌクレアーゼを構造的および生化学的に特徴付け、進化モデルを開発し、治療標的の基礎を提供することを目指しています。ヌクレアーゼは、細胞DNAまたはRNAの酵素活性により、大腸菌系で発現するのが難しい場合があり、その結果、成長が遅くなり、タンパク質収量が低下する可能性があります。私たちの発見により、他のニドウイルスから有毒なヌクレアーゼを精製し、さらなる下流の生化学的および構造的研究を行うことができます。

まず、培養物1リットルごとに50ミリリットルの滅菌三角フラスコを1つ使用し、スターター培養物として2〜3つの追加のフラスコを準備します。フラスコ間の視覚的な違いがない限り、その測定値は成長全体を表すため、フラスコの1つに星のラベルを付けて光学密度チェック用に指定します。メスシリンダーを使用して、摂氏マイナス20度から解凍した60ミリリットルの2X TY培地と60マイクロリットルのアンピシリン原液を混ぜてマスターミックスを調製します。

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