質量分析によるエピジェネティックプロファイリングのための臨床標本からヒストン抽出

私たちの研究の範囲は、がんサンプルにおけるエピジェネティック変化の解析、新たな診断および予後バイオマーカーの発見、治療の潜在的な標的の特定です。臨床サンプルの大きな課題は、材料の制限と固定による人工物の存在です。しかし、最適化されたワークフローとdi感度のMSにより、わずか1000個の細胞から最大50個のヒストンPTMを定量化できます。

質量分析法が臨床サンプル中のヒストンPTM変化を定量化できることを示し、エピジェネティックメカニズムへの洞察を提供し、バイオマーカーの発見や精密なエピジェネティック治療のための薬物標的同定を可能にします。当プロトコルは、さまざまな臨床サンプルにおけるヒストンPTMに関する堅牢で定量的かつ感度の高いプロファイリングの必要性に対応しています。質量分析法はヒストンPTM解析に理想的であり、同じペプチド上で無偏検出、同時プロファイリング、共現を提供し、抗体ベースの手法の限界を克服します。

まず、新鮮に凍った組織を氷で解凍し、メスや刃で約20〜30ミリグラムの組織を切り取ります。これは約2立方ミリメートルの組織に相当します。切断した組織サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。はさみを使って組織を小さく刻みます。

新たに調製した核分離バッファーを1ミリリットル加え、指定されたプロテアーゼ阻害剤を補足して再度組織を粉砕します。サンプルをダウンホモジナイザーに移します。まずゆるい乳棒を使い、次にきつく固く乳棒を使い、肉眼で見える破片が残らないまで組織を均質化します。

均質化されたサンプルを100マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、組織の残骸を除去します。200マイクロリットルのピペットで、ろ過したサンプルを激しく上下にピペットで溶かし、細胞膜を溶解させます。サンプルを新しい1.5ミリリットルのチューブに移してください。

チューブをベンチトップの遠心分離機に入れ、2,300Gで4度の摂氏で15分間回して核を粒状にします。上清液を捨てた後、核ペレットを50〜100マイクロリットルの核分離バッファーに再懸浮させ、0.1%SDSを補足して核膜を溶解させます。次に、再懸浮サンプルに250単位のベンゾナーゼヌクレアーゼを加えて核酸を分解します。

よく混ぜて37度で2分間孵化します。最適な切断温度の冷凍サンプルのために、組織をエタノール水とPBSで洗浄してからミンチとヒストン抽出を行います。1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルのパラフィン溶解剤をFFPEサンプルに加え、最大速度で30秒間渦巻きしてパラフィンが完全に溶解するまで加熱します。

サンプルを室温で16,000Gで3分間遠心分離し、ペレットを避ける小さなチップが付いたピペットで上清液を慎重に捨てます。次にペレットに95%エタノールを1ミリリットル加え、最大速度で30秒間渦巻きます。サンプルを16,000Gで室温で3分間遠心分離し、上澄液を捨てます。

サンプルを再水和した後、ペレットに200マイクロリットルの抽出バッファーを加えます。抽出バッファー内の組織を均質化するには、3ミリのマイクロチップを使ってデジタルシグニファイアと交わします。均質化後、サンプルをサーモミキサーで培養し、チューブの蓋を一時的に開けてホルムアルデヒドを蒸発させます。

サンプルを遠心分離した後、上清液を新しいラベル付きチューブに移します。10キロダルトンから18キロダルトンのコアヒストンタンパク質の分子量に対応するゲルバンドをメスで切除します。ゲルバンドを切断した後、同じメスで切断したジェル片を1.5ミリリットルのチューブに移します。

ゲルを染色するには、アセトニトリル50%を二重蒸留水に溶かし、室温で10分間毎分1,400回転のサーモミキサーで培養します。ジェルの断片は100%アセトニトリルを加えて脱水します。サーモミキサーを室温で10分間、毎分1,400回転で混ぜます。

上澄液を捨てた後、ゲル片を室温で真空遠心分離機で5分間乾燥させます。次に、各チューブに7.7モルプロポニカンヒドリド溶液15マイクロリットルと炭酸水素アンモニウム126マイクロリットルを加えて培養します。その後、サンプルを1モルの重炭酸アンモニウム80マイクロリットルで培養します。

その後、ゲル片を二重蒸留水で3回洗い、各培養後に液体を捨てます。次に、ゲル片に50%アセトンニトリルを加え、室温で1,400回転毎分15分間キュベーションします。次に100%アセトニトリルを加えてジェルの破片を完全に脱水させます。

室温で1,400回転毎分15分間、サーモミキサーで培養します。液体を捨てた後、ゲル片を室温の真空遠心分離機で5分間乾燥させます。ゲル片を含む各チューブにトリプシン溶液4マイクロリットルと消化バッファー20マイクロリットルを加えます。

チューブを氷で10分間孵化させ、トリプシンがゲルに吸収されるようにします。トリプシンが完全に吸収されたら、80マイクロリットルの消化バッファーを加えてゲル片を完全に覆い、チューブを37度の温度でサーモミキサーで一晩培養します。消化ペプチドを抽出するには、各チューブに100マイクロリットルの100%アセトニトリルを加え、室温のサーモミキサーで毎分1,400回転で20分間培養します。

次に、上清液を慎重に採取し、新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。残ったゲルでアセトニトロ抽出を繰り返した後、上澄液をプールします。プールしたペプチドを真空遠心分離機で1〜5マイクロリットルの間まで濃縮します。

次に、1モルのトリエチルアンモニウム重炭酸塩溶液を2マイクロリットル、フェニルイソシアン酸溶液を3マイクロリットル加えます。サンプルを350回転毎分、37度の温度で90分間、サーモミキサーで培養します。誘導化を防ぐために、各チューブに1%トリクロロ酢酸を8マイクロリットル加えます。

最後に、各サンプルにバッファーAを100マイクロリットル追加して希釈し、希釈したサンプルをC18ステージの先端に積み込み、洗出します。ヒスターン抽出は、新鮮な凍結、OCT凍結、FFPEサンプルから、各組織タイプに特化した差分処理ワークフローを用いて成功裏に達成されました。低濃度および背景タンパク質の存在にもかかわらず、フレーンのFFPEサンプルからヒストンH3、H2A、H2B、H4が成功裏に抽出され、レーンのFFPE1およびFFPE2のバンドは約1マイクログラムのH3.1標準値に一致しています。

FFPE由来ヒストンのナノ液体クロマトグラフィーおよびMS解析では、55分の勾配でヒストンペプチドの分離に成功し、全イオンクロマトグラムで明確な保持時間ピークが確認されました。抽出されたイオンクロマトグラムにより、各M×Z値ごとに異なる希釈プロファイルを持つ、修飾されていないメチル化されたH3 K 4の検出および定量が確認されました。これにより、各修飾に対する相対存在比の割合の計算が可能になります。

正常サンプルと腫瘍サンプル間のヒストン修飾の比較解析では、特定のタイプで有意に増加し、他のタイプでは減少することが明らかになりました。