Name: LEXYおよびLINuSオプトジェネティクスツールと自動画像解析を使用して、生細胞の核細胞質輸送ダイナミクスを定量化します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶオプトジェネティクスツールと自動画像解析を用いた生細胞の核細胞質輸送ダイナミクス定量化法。細胞輸送メカニズムの理解に貢献する革新的なアプローチを紹介します。

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<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
<li>Kelley, J. B., Paschal, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+quantification+of+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport.</a> Methods. 157, 106-114 (2019).</li>
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<li>Niopek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+light-inducible+nuclear+localization+signals+for+precise+spatiotemporal+control+of+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells.</a> Nat Commun. 5, 4404(2014).</li>
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<li>Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminal+helix+modulates+light+activated+conformational+changes+in+AsLOV2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2.</a> J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).</li>
<li>Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+import+in+living+cells+using+light-inducible+nuclear+localization+signals+%28LINuS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS).</a> Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).</li>
<li>Lataster, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+optogenetically+regulated+cell+cycle+inhibitor+protein+p21%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21.</a> Biology. 12 (9), 1194(2023).</li>
<li>Forlani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+slow-cycling+variants+of+the+light-inducible+nuclear+protein+export+system+LEXY+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).</li>
<li>Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+blue+light+transmission+area+in+living+animals+using+light-induced+nuclear+translocation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
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<li>Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAc+modification+of+nuclear+pore+complexes+accelerates+bidirectional+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).</li>
<li>Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., Todaro, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+sarcoma+and+leukemia+viruses%3A+assay+using+clonal+lines+of+contact-inhibited+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells.</a> J Virol. 4 (5), 549-553 (1969).</li>
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<li>Henderson, B. R., Eleftheriou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+activity%2C+sequence+specificity%2C+and+CRM1-dependence+of+different+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals.</a> Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+nuclear+localization+signals+and+mechanisms+of+protein+import+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signaling%22%5BJournal%5D)">Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus.</a> Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), dev175067(2019).</li>
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<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiking+of+Cas9+with+nucleus-localized+proteins+impairs+its+controllability+and+leads+to+efficient+genome+editing+of+NLS-free+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9.</a> Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).</li>
</ol>

核細胞質輸送(NCT)が主要な細胞経路を調節し、細胞の恒常性を維持するための重要性は、ここ数年でよく研究されてきました1。その結果、NCTのダイナミクスを研究するためのいくつかのツールが生成されました2,3,4。これらのツールの中で、2014年と2016年にそれぞれ発表されたLINuS5およびLEXY6光遺伝学的プローブは、生細胞中のNCTをモニタリングする強力な方法を提供します。これらのツールは、蛍光レポーターの誘導性エクスポート(LEXY)またはインポート(LINuS)のいずれかを追跡するように設計されており、ブルーライトへの曝露によって誘導され、可逆的です。
簡単に言うと、これら2つの小さなプローブは、植物 Avena sativa7のタンパク質フォトトロピン-1由来のLOV2ドメインの特性を利用しています。青色光がない場合、LOV2ドメインからのJαヘリックスは光ケージに入れられ、タンパク質コアに埋め込まれます。Jαヘリックスは光刺激に応答するため、青色光による照射によりコンフォメーション変化が起こり、それに続いてJαヘリックがLOV2ドメインから切り離されます。LEXYとLINuSの著者は、この光感度を使用して、それぞれLINuSとLEXYについて、核局在化信号(NLS)または核エクスポート信号(NES)をJαヘリックスに融合させました(図1)。その結果、ブルーライト照射時に核(LINuS)またはサイトゾル(LEXY)に移行するプローブが得られます。
蛍光イメージングでプローブを追跡するために、mCherry蛍光レポーターもコンストラクトに追加しました。最後に、弱いNES(LINuS用)またはNLS(LEXY用)をシステムに追加して、プローブが青色光照射前に最終的な局在化にならないようにしました。これにより、核と細胞質との間のLEXYまたはLINuSの転座が観察されるのを防ぐことができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg"> 
図1:LEXYプローブとLINuSプローブの図。 どちらのプローブも、光感受性LOV2ドメインに融合したmCherryタンパク質で構成されています。この2つのツールの違いは、Jαヘリックスによって隠されたシグナル伝達シーケンス、つまりLEXYのNESとLINuSのNLSにあります。また、どちらのプローブも、初期局在を制御するための弱いシグナル配列(LEXYには弱いNLS、LINuSには弱いNES)を持っています。したがって、ブルーライト照明によるシステムの活性化により、LEXYへのエクスポートまたはLINuSへのインポートが誘導され、ユーザーは核の輸出または輸入を監視できるようになります。略語:LEXY =光誘導性核輸出システム;LINuS = 光誘導性核局在化シグナル;NLS = 核局在化信号;NES = 核輸出信号。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
mCherry蛍光の局在は、核とサイトゾルの間のLEXYプローブとLINuSプローブのシャトルを報告するため、生細胞イメージングで追跡でき、ユーザーはNCTをモニターできます。LEXYおよびLINuSは、単純なプローブとして使用するだけでなく、in vitro 5,6,8,9またはin vivo10,11で目的のタンパク質の局在を制御し、研究するように操作することもできます。
LEXYおよびLINuSの出版物で提案されている定量法は、プローブの相対的な核強度を示しています。推奨される分析は手動で行われ、核とサイトゾルの関心領域(ROI)の測定に依存しています。この方法は、プローブの信号を経時的に適切に表現できますが、特に実験や条件が繰り返される場合は、非常に長くて面倒です。重要なことは、この方法は、設計されたコンパートメントのごく一部しか表されないため、精度にも欠けていることです。
ここでは、LEXYおよびLINuS蛍光シグナル定量のための新しいプロトコルを提案します。私たちは自動化技術を導入し、分析を容易にし、より高い精度を提供します。これにより、これらのツールの新規ユーザーのプロセスが容易になり、スループットが向上します。当社の定量化プロトコルは、FIJIのオープンソースのTrackMate12 プラグインという1つのインターフェースのみを使用します。特に、定量の信頼性を向上させるために、ライブイメージング対応の遠赤外DNAマーカーを使用して、訓練された畳み込みニューラルネットワークであるStarDist13で全核セグメンテーションを行い、TrackMate12でプローブの蛍光シグナルを追跡および測定しました。
取得したデータは、すぐに使用できるスプレッドシート(補足表S1)に簡単にエクスポートして、同定された各核の相対核強度を取得できます。このプロトコルでは、YooとMitchison14 のように、得られた時間経過曲線を単指数モデルに当てはめて、得られた値をグラフにプールする方法や、テストしたさまざまな条件の輸送速度を計算する方法についても説明しています。このプロトコルと解析用のスプレッドシートを使用すれば、バイオインフォマティクスのスキルが限られている場合でも、ユーザーは生細胞イメージングデータを簡単に定量化することができます。

<table><tbody><tr><td>コラーゲン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEMの</td><td>ギブコ</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>秀でる</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBSの</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FIJIソフトウェア</td><td>フィジー</td><td></td><td>イメージJ 2.16.0/1,54p;Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>フッ素ディッシュ</td><td>ダッチャー</td><td>FD3510-100</td><td>代替:Attofluorチャンバー(Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム 10.4.1</td><td>GraphPad ソフトウェア株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インポートタゾール</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>レプトマイシンB</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>LEXYプラスミド</td><td>アドジーン</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>LINuSプラスミド</td><td>アドジーン</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>ペンシリン-ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドフリーDMEM</td><td>ギブコ</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td>スピロクロム</td><td>SC007</td><td>代替品:SPY-DNA650(スピロクロム #SC501)</td></tr><tr><td>Stardist 2Dプラグイン</td><td>スターディスト</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>TrackMateプラグイン</td><td>トラックメイト</td><td></td><td>トラックメイト-7.14.0</td></tr></tbody></table>

lexyおよびlinusオプトジェネティクスツールと自動画像解析を使用して、生細胞の核細胞質輸送ダイナミクスを定量化します

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

上記のプロトコルにより、ユーザーは、生細胞イメージングにおける取得中にプローブの局在化および転座を視覚化できるはずです。LEXYで核の輸出を視覚化するために取得される予定の画像の例を 図4に示します。核からのシグナルの急速な減少とサイトゾルの濃縮は、ブルーライト照明を数回行った後に観察されるべきです。プローブの信号の漸進的な回復は、照明サイクルを停止した後に見ることができます。このシステムを制御するために、輸出阻害剤であるレプトマイシンBは、青色光照射時にLEXYが輸出されるのを防ぐため、分析によって輸出の変化を可視化できることを証明しています(図4)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg"> 
図4:LEXYのシグナルの経時的な視覚化。 生細胞イメージングで取得した、安定期、照明期、および回復期の代表的な時点のキャプチャ。メタノール条件は制御条件を表します。脈動性の青色光が赤色で照射されると、LEXYの位置を示すレポーターであるmCherry蛍光シグナルが核から細胞質に移されます。照明を停止した後、信号は原子核内で回復します。輸出阻害剤であるレプトマイシンBを1 nMまたは0.5 nMで投与すると、輸出がブロックされた場合、LEXYの輸出が存在しないか減少することが示されています。スケールバー = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
解析に関しては、安定期の相対核強度曲線の値は1程度であるべきですが、青色光の活性化後は、照明期の終わりにプラトーに達するまでゆっくりと減少するはずです(図5A)。減少が速すぎるか遅すぎる場合は、取得パラメータを最適化できます(説明を参照)。十分な濃度でのレプトマイシンB処理は、分析と技術が核の輸出が完全にブロックされ、実験全体で相対的な核強度値が約1で安定していることを示すのに十分な感度であることも確認できます。ただし、中程度のレプトマイシンB濃度は、軽度の核外輸送を示すはずです(図5A)。これらの目視観察は、輸出率の取得とともに定量的に確認する必要があります(図5B)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg"> 
図5:LEXYの予想相対核強度と輸送速度(A)グラフは、LEXYの蛍光シグナルの経時的な相対核強度を表しており、安定相のmCherry平均強度に正規化されています。メタノール(コントロール、赤)条件の相対核強度は、輸出阻害剤レプトマイシンBで処理された細胞とは対照的に、0.5nM(水色)または1nM(濃色)の濃度で、照明後に半分に減少します。エラーバー:SEM.(B)曲線を単指数モデルに適合させることによって得られた、コントロールおよびレプトマイシンB条件のエクスポート率。レプトマイシンBによって輸出がブロックされたときに得られる値は、制御条件よりも大幅に低くなっています。N=メタノール(赤)は18細胞、レプトマイシンBは19細胞0.5nM(水色)、レプトマイシンB1nM(紺色)は15細胞です。P値は、両側ウェルチのt検定によって計算されました。: P &lt; 1×10−4, ****: P &lt; 1×10−5.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 S1: 事前定義された計算を含むスプレッドシート。 このスプレッドシートは、分析を容易にするために提供されています。TrackMateで取得した強度値は、直接コピーしてスプレッドシートに貼り付けて、正規化された相対核強度値を取得できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S2:LEXYの分析の制御条件で期待される結果の例。 このスプレッドシートは、LEXYの安定細胞株の制御条件で得られた値の例を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

LEXYおよびLINuSオプトジェネティクスツールと自動画像解析を使用して、生細胞の核細胞質輸送ダイナミクスを定量化します

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

私たちの研究室では、核孔とクロマチン組織の相互作用を研究しています。そこで私たちは、核孔がクロマチン組織にどのように影響するかを研究しますが、クロマチン組織が核孔機能、特に核細胞質輸送に影響を与えるかどうかも研究します。核細胞質輸送は非常に高速なプロセスであるため、生細胞における核細胞質輸送のダイナミクスの変化を検出することが課題の1つです。生細胞内の核細胞質輸送を監視するために利用できるツールは多くありません。半自動化および改良された技術を実装することで、これらのツールの使用を容易にしたいと考えています。私たちのプロトコルはディープラーニングに基づいています。誤差を制限し、解析に必要な時間を大幅に短縮します。以前は1日かかっていたことが、今では1時間か2時間しかかかりません。まず、コンピュータシステムでFIJIソフトウェアを起動します。安定相を画像1として、照明相を画像2として、回復相を画像3として選択します。3つのフェーズを表す3つの画像を連結して、1つの画像を作成します。取得したマージされた画像をセグメンテーション用に保存するには、[ファイル] に移動し、[TIFF として保存] を選択します。次に、[画像]、[色]、および[チャネルの分割]を選択して、mCherryチャネルを分割します。次に、[ファイル]、[名前を付けて保存]、および [TIFF] に移動して分割画像を保存します。取得中に漂白を確認するには、画像、スタック、およびプロットZ軸プロファイルを順番に選択します。次に、[データ]をクリックし、続いて[最初のデータセットをコピー]をクリックし、Z軸プロファイルセルの下にあるスプレッドシートに貼り付けます。次に、[分析]、[ツール]、[ROI マネージャー] の順にクリックして、原子核の平均サイズを近似する円形の関心領域を描画します。ROI を追加し、[その他] に移動し、[保存] をクリックして保存します。タイムラプス中は、保存したROIをセルのない領域に配置します。[測定値の解析と設定]で[平均グレー値]が選択されていることを確認してください。次に、[その他]、[マルチメジャー]の順にクリックします。「50 スライスすべてを測定」と「スライスごとに 1 つの ROI」にチェックを入れ、「OK」をクリックして強度を記録します。測定されたすべての強度値をコピーして、ROIの背景セルの下にあるスプレッドシートに貼り付けます。次に、mCherry チャネルのみで画像を閉じ、マージされたチャネルで保存された画像を選択します。次に、Plugins、Tracking、TrackMateを順番にクリックして、TrackMateプラグインを開きます。時点の範囲が 0 から 49 であることを確認し、[次へ] をクリックします。StarDist検出器を選択し、[Next]をクリックします。核セグメンテーションにチャネル2、SiR-DNAを選択し、プロセスが完了するまで待ちます。しきい値ウィンドウにデフォルトのパラメーターを残して、[次へ]をクリックします。平均強度、チャネル 1 を使用してフィルターを作成し、極端な信号値を持つ原子核を除外します。1 つのフィルターを作成して、定義されたしきい値を超える値を選択し、もう 1 つのフィルターを作成して、しきい値を下回る値を選択します。同様に、2 つのエリア フィルターを追加して、破片や死にかけている細胞を削除し、[次へ] をクリックします。シンプルLAPトラッカーを選択し、[次へ]をクリックします。次に、トラッキングパラメータを調整します。[リンク最大距離]を 30 マイクロメートル、[ギャップ閉鎖最大距離] を 15 マイクロメートル、[ギャップ閉鎖最大フレーム ギャップ] を 3 に設定します。次に、[次へ] をクリックします。計算が終わったら、次へをクリックしてトラックにフィルターを設定します。全時間コースで追跡された核のみを選択するには、トラック内の最大数のスポットを選択して[次へ]をクリックします。次に、スポット名の表示」にチェックを入れて、さらなる分析で各核をトレースし、必要に応じて他の表示機能をカスタマイズします。ページ下部の「トラック」をクリックし、「CSVにエクスポート」を選択して測定表を保存します。テーブルを閉じて、[次へ] をクリックして続行します。次に、アクションとして「オーバーレイのキャプチャ」をクリックし、[実行]を押してから[OK]を押して、追跡された核を含む画像を生成します。[ファイル]、[名前を付けて保存]を順番にクリックし、[TIFF]を選択して画像を保存します。TrackMate CSV ファイルを提供されたスプレッドシートにインポートするには、[データ] タブをクリックします。[変換データの取得]グループで、[テキスト/ CSVから]をクリックし、[インポート]をクリックします。列スポットIDB、トラックIDC、フレームI、および平均強度チャネル1Mをコピーし、提供されたスプレッドシートの列AからDに貼り付けます。結果をアルファベット順に、最初にセル B5 のトラック ID、個々の核、次にセル C5 のフレーム、時点で並べ替えます。次に、GraphPad Prismを開き、新しいシートを作成し、スプレッドシートから時間列をコピーして貼り付けます。次に、相対核強度として取得した値をGraphPadプリズムテーブルに貼り付けます。相対核強度グラフを生成するには、[グラフ]セクションに移動し、グラフファミリーとして[XY]を選択します。次に、グラフの種類として「ポイントとエラーバーのある接続線」を選択します。プロット設定で、平均値と誤差、SEMを選択し、OKをクリックします。次に、エクスポートレートを取得するには、[新しいデータテーブル]をクリックし、安定フェーズと照明フェーズのみの時間を小数点で入力します。これらの相の相対核強度として得られた値を表に貼り付けます。[結果]セクションで、[XY分析]をクリックし、続いて[指数関数]をクリックします。次に、[非線形回帰] を選択し、[OK] をクリックします。パラメータの下のモデルとして、Plateau then then one phase decay」を選択します。次に、プラトーの定数を X0 として 2.25 に等しく、1 に等しい定数を Y0 として、およびプラトーの定数を 0 として選択します。K が 0 より大きくなければならないことを示し、OK を押します。新しいテーブルを作成し、取得した K 値を貼り付けて転置します。[グラフ] セクションで、グラフ ファミリとして [列] を選択し、グラフ タイプとしてバイオリン プロットを選択します。プロットとして「すべての点を表示」を選択し、「OK」をクリックします。光遺伝学的プローブlexyによる核輸出は、生細胞イメージングで視覚化されました。メタノール処理細胞を用いた対照条件では、青色光照射後に核mCherry強度が急激に低下し、その後、照射後の段階で徐々に回復しました。輸出阻害剤であるレプトマイシンBによる治療は、プローブ信号がすべての時点で一貫して核のままだったため、核輸出に変化を引き起こしました。相対核強度の定量分析により、照明段階の終わりにプラトーに達するまで、時間の経過とともにゆっくりと減少することが示されました。中間のレプトマイシンB濃度は、穏やかな核輸出を示すはずです。強度データから計算された輸出率は、メタノール処理細胞で有意に高い輸出率、0.5ナノモルのレプトマイシンBでははるかに低い率、および1ナノモルのレプトマイシンBでの輸出がほとんどないことを確認しました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶオプトジェネティクスツールと自動画像解析を用いた生細胞の核細胞質輸送ダイナミクス定量化法。細胞輸送メカニズムの理解に貢献する革新的なアプローチを紹介します。

LEXYおよびLINuSオプトジェネティクスツールと自動画像解析を使用して、生細胞の核細胞質輸送ダイナミクスを定量化します

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