ウシ卵巣における顆粒膜‐テカ細胞相互作用を理解するための改良共培養システム

ウシテカ細胞と顆粒膜細胞の共培養は、卵胞のステロイド生成細胞間のパラクリンシグナル伝達と基質輸送を分析するための信頼できる基盤として機能します。このモデルは、in vivo環境と同様にテカ細胞と顆粒膜細胞の区画化を可能にし、市販のインサートを使用することで、再現性と標準化された細胞培養が可能になります。卵胞形成の過程での基質交換や卵胞動態など、顆粒膜細胞の相互作用をより詳細に調査するための生理学的関連環境を作成することができます。

まず、ウシの卵巣を入手します。抗生物質を添加したPBSでウシの卵巣を3回洗浄し、表面から血液と残留物を取り除きます。卵巣をタンブラーに入れます。

卵巣を覆うのに十分なだけPBSで満たし、溶液を捨てます。次に、PBS を追加します。1つの卵巣をガラス皿に入れます。

定規を使用して、解剖用の直径5〜11ミリメートルの卵胞を測定および選択します。次に、3ミリリットルの注射器に取り付けられた18ゲージの針で選択した卵胞に穴を開けて、卵胞液を吸引します。卵胞液はすぐに廃棄してください。

卵胞を双眼顕微鏡下で移します。はさみで、穿刺部位で卵胞を切り開きます。ピンセットを使用して、開いた毛包の内面からテカの内層をつかみます。

内側の内側の毛包壁からそっと内側を剥がします。テカ細胞層を抗生物質を添加したPBSを含む皿に移し、残りの顆粒膜細胞を洗い流します。次に、メスを使用して、膜表面から顆粒膜細胞をそっとこすり落とします。

メンブレンを新しいPBSを入れた新しい皿に入れて洗浄します。膜をバッファー内で穏やかに旋回させてすすぎ、残留細胞を除去します。theca internaを12ウェルプレートのウェル内の調製した消化液に移します。

メスを使って1〜3ミリサイズに切ります。次に、組織片を準備した1.5ミリリットルの反応チューブに移します。チューブを魔法瓶振とうインキュベーターでインキュベートします。

30分間のインキュベーション後、チューブを3〜5秒間ボルテックスしてから、インキュベーターに戻します。残りのインキュベーション期間にわたって、このボルテックスステップをさらに3回繰り返します。インキュベーションが完了したら、ピペットを使用して消化した細胞を再懸濁します。

溶液を50ミリリットルのチューブに置いた100マイクロメートルのセルストレーナーに通し、未消化の組織を除去します。テカ細胞を培養するための接種チャンバーを準備します。コーティングされたインサートを逆さまにして、12ウェルプレートなどの大きなプレートに入れます。

テカ細胞懸濁液を500Gで摂氏約20度で3分間遠心分離します。上清を捨てます。次に、ペレットを補充されたアルファミニマム必須培地に再懸濁します。

200マイクロリットルの細胞懸濁液を接種チャンバーに播種します。細胞培養皿を閉じるには、皿の各隅に配置された1.5ミリリットルの反応チューブからカットおよびオートクレーブ滅菌されたキャップを使用して、プレートと蓋の間の距離を広げます。インサートをずらさずにウェルプレートを慎重に閉じます。

次に、閉じたプレートを加湿したインキュベーターにそっと移します。24ウェルプレートに、所望の各ウェルに500マイクロリットルの培地を入れます。ピンセットを使用してチャンバーをインサートからそっと取り外します。

付着したテカ細胞を含むインサートを、テカを下にして24ウェルプレートに入れます。顆粒膜細胞を播種するには、各インサート内に250マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットで入れます。共培養を摂氏37度で5%二酸化炭素とともに6日間インキュベートします。

顆粒膜細胞播種後48時間ごとに培地量の2/3を交換して培地交換を行います。テカ細胞はCYP17A1のみを発現しましたが、顆粒膜細胞は主にCYP19A1を発現しました。培養3日後、テカ細胞はコラーゲンでコーティングされた膜に平らで細長い形態を示し、付着が成功したことを示しています。

9日間単独で培養すると、テカ細胞は増殖し、9日目までに合流点に達しました。6日間単独で培養した顆粒膜細胞は線維芽細胞様の形態を発達させ、in vitroの挙動に特徴的なクラスターを形成した。共培養システムでは、それぞれの単培養と比較して、どちらの細胞型でも形態学的差異は観察されませんでした。

エストラジオールレベルは、顆粒膜細胞単一培養と共培養の間で同様でした。一方、細胞単培養ではごくわずかな量しか生成されませんでした。CYP17A1発現は、単一培養条件と共培養条件の両方でテカ細胞に限定されたままでした。

CYP19A1発現は、単一培養条件と共培養条件の両方で顆粒膜細胞に限定されたままでした。