Name: ウシ卵巣における顆粒膜‐テカ細胞相互作用を理解するための改良共培養システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶウシ卵巣の顆粒膜細胞とテカ細胞の共培養法。膜インサートを用いたこのモデルは、パラクリンシグナル伝達と基質輸送を解析し、卵胞動態と細胞間相互作用を詳細に調べる生理学的環境を提供します。

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<ol><li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Forde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrous+cycles+in+Bos+taurus+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Oestrous cycles in Bos taurus cattle.</a> Anim Reprod Sci. 124 (3-4), 163-169 (2011).</li>
<li>Hennet, M. L., Combelles, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antral+follicle%3A+A+microenvironment+for+oocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The antral follicle: A microenvironment for oocyte differentiation.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 819-831 (2012).</li>
<li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+resource%3A+Preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Research resource: Preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Mol Endocrinol. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell Tissue Res. 354, 869-880 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue+culture+model+of+estrogen-producing+primary+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells.</a> J Vis Exp. (139), e58208(2018).</li>
<li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system%3A+Induction+and+maintenance+of+estradiol+production%2C+response+to+follicle-+stimulating+hormone%2C+and+morphological+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: Induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biol Reprod. 56 (3), 608-616 (1997).</li>
<li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androstenedione+increases+cytochrome+P450+aromatase+messenger+ribonucleic+acid+transcripts+in+non-luteinizing+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Androstenedione increases cytochrome P450 aromatase messenger ribonucleic acid transcripts in non-luteinizing bovine granulosa cells.</a> Mol Reprod Dev. 70, 175-183 (2005).</li>
<li>Chandrasekher, Y. A., Fortune, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxytocin+on+steroidogenesis+by+bovine+theca+and+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxytocin on steroidogenesis by bovine theca and granulosa cells.</a> Endocrinology. 127 (2), 926-933 (1990).</li>
<li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 62 (1), 186-191 (2000).</li>
<li>Gong, J. G., McBride, D., Bramley, T. A., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+recombinant+bovine+somatotrophin%2C+insulin-like+growth+factor-I+and+insulin+on+bovine+granulosa+cell+steroidogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of recombinant bovine somatotrophin, insulin-like growth factor-I and insulin on bovine granulosa cell steroidogenesis in vitro.</a> J Endocrinol. 143 (1), 157-164 (1994).</li>
<li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-lactate+induces+specific+genome-wide+alterations+of+gene+expression+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">L-lactate induces specific genome-wide alterations of gene expression in cultured bovine granulosa cells.</a> BMC Genomics. 20 (1), 273(2019).</li>
<li>Baddela, V. S., Sharma, A., Plinski, C., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+protects+granulosa+cells+from+oleic+acid+induced+steatosis+and+rescues+progesterone+production+via+cAMP+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Biol+Lipids%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid protects granulosa cells from oleic acid induced steatosis and rescues progesterone production via cAMP dependent mechanism.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1867 (8), 159159(2022).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+free+fatty+acids+affect+bovine+granulosa+cell+function%3A+a+molecular+cue+for+compromised+reproduction+during+negative+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Connect%22%5BJournal%5D)">Elevated free fatty acids affect bovine granulosa cell function: a molecular cue for compromised reproduction during negative energy balance.</a> Endocr Connect. 8 (5), 493-505 (2019).</li>
<li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+oestrogen+synthesis+-+The+two-cell%2C+two-+gonadotrophin+model+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Follicular oestrogen synthesis - The two-cell, two- gonadotrophin model revisited.</a> Mol Cell Endocrinol. 100, 51-54 (1994).</li>
<li>Campen, K. A., Lavallee, M., Combelles, C. M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bisphenol+S+on+bovine+granulosa+and+theca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">The impact of bisphenol S on bovine granulosa and theca cells.</a> Reprod Domest Anim. 53 (2), 450-457 (2018).</li>
<li>Glister, C., Richards, S. L., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+%28BMP%29+-4%2C+-6%2C+and+-7+potently+suppress+basal+and+luteinizing+hormone-induced+androgen+production+by+bovine+theca+interna+cells+in+primary+culture%3A+could+ovarian+hyperandrogenic+dysfunction+be+caused+by+a+defect+in+thecal+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins (BMP) -4, -6, and -7 potently suppress basal and luteinizing hormone-induced androgen production by bovine theca interna cells in primary culture: could ovarian hyperandrogenic dysfunction be caused by a defect in thecal BMP signaling.</a> Endocrinology. 146 (4), 1883-1892 (2005).</li>
<li>Wrathall, J. H., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibin-related+peptides+and+oestradiol+on+androstenedione+and+progesterone+secretion+by+bovine+theca+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibin-related peptides and oestradiol on androstenedione and progesterone secretion by bovine theca cells in vitro.</a> J Endocrinol. 145 (3), 491-500 (1995).</li>
<li>Shores, E. M., Picton, H. M., Hunter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+pig+theca+cell+steroidogenesis+by+LH%2C+insulin-like+growth+factor+I+and+granulosa+cells+in+serum-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of pig theca cell steroidogenesis by LH, insulin-like growth factor I and granulosa cells in serum-free culture.</a> J Reprod Fertil. 118 (2), 211-219 (2000).</li>
<li>Gregoraszczuk, E. L., Ptak, A., Karniewska, M., Ropstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+defined+mixtures+of+PCBs%2C+p%2Cp%27-DDT+and+its+metabolite+p%2Cp%27-DDE%2C+on+co-culture+of+porcine+theca+and+granulosa+cells%3A+steroid+secretion%2C+cell+proliferation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Action of defined mixtures of PCBs, p,p'-DDT and its metabolite p,p'-DDE, on co-culture of porcine theca and granulosa cells: steroid secretion, cell proliferation and apoptosis.</a> Reprod Toxicol. 26 (2), 170-174 (2008).</li>
<li>Rak, A., Drwal, E., Wróbel, A., Gregoraszczuk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistin+is+a+survival+factor+for+porcine+ovarian+follicular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Resistin is a survival factor for porcine ovarian follicular cells.</a> Reproduction. 150 (4), 343-355 (2015).</li>
<li>Kotsuji, F., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The role of granulosa and theca cell interactions in ovarian structure and function.</a> Microsc Res Tech. 27 (2), 97-107 (1994).</li>
<li>Orisaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+granulosa+cell+differentiation+during+gonadotropin-independent+follicular+growth+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on granulosa cell differentiation during gonadotropin-independent follicular growth in cattle.</a> Mol Reprod Dev. 73 (6), 737-744 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Role of granulosa and theca cell interactions in ovarian follicular maturation.</a> Microsc Res Tech. 69 (6), 450-458 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+apoptosis+and+proliferation+of+granulosa+cells%3A+changes+during+bovine+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on apoptosis and proliferation of granulosa cells: changes during bovine follicular maturation.</a> Biol Reprod. 66 (6), 1635-1639 (2002).</li>
<li>Allegrucci, C., Hunter, M. G., Webb, R., Luck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bovine+granulosa+and+theca+cells+in+a+novel+serum-free+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interaction of bovine granulosa and theca cells in a novel serum-free co-culture system.</a> Reproduction. 126 (4), 527-538 (2003).</li>
<li>Santaguida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+by+side+comparison+between+dynamic+versus+static+models+of+blood-brain+barrier+in+vitro%3A+A+permeability+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: A permeability study.</a> Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolated+Brain+Microvessel%3A+A+Versatile+Experimental+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Isolated Brain Microvessel: A Versatile Experimental Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Front Physiol. 11, 398(2020).</li>
<li>Schneider, F., Brüssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reprod Fertil Dev. 18 (8), 857-866 (2006).</li>
<li>Nimz, M., Spitschak, M., Schneider, F., Fürbass, R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+genes+encoding+steroidogenic+enzymes+and+hormone+receptors+in+late+preovulatory+follicles+of+the+cow+coincides+with+an+accumulation+of+intrafollicular+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of genes encoding steroidogenic enzymes and hormone receptors in late preovulatory follicles of the cow coincides with an accumulation of intrafollicular steroids.</a> Domest Anim Endocrinol. 37, 45-54 (2009).</li>
<li>Amsterdam, A., May, J. V., Schomberg, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+insulin+and+follicle-stimulating+hormone+on+biochemical+and+morphological+differentiation+of+porcine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of insulin and follicle-stimulating hormone on biochemical and morphological differentiation of porcine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 39 (2), 379-390 (1988).</li>
<li>Monga, R., Sharma, I., Datta, T. K., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+serum-free+buffalo+granulosa+cell+culture+and+analysis+of+genes+involved+in+terminal+differentiation+from+FSH-+to+LH-responsive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Characterization of serum-free buffalo granulosa cell culture and analysis of genes involved in terminal differentiation from FSH- to LH-responsive phenotype.</a> Domest Anim Endocrinol. 41 (4), 195-206 (2011).</li>
<li>Bao, B., Garverick, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+steroidogenic+enzyme+and+gonadotropin+receptor+genes+in+bovine+follicles+during+ovarian+follicular+waves%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of steroidogenic enzyme and gonadotropin receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves: A review.</a> J Anim Sci. 76 (7), 1903-1921 (1998).</li>
<li>Bao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+messenger+ribonucleic+acid+encoding+luteinizing+hormone+receptor%2C+cytochrome+P450+side+chain+cleavage%2C+and+aromatase+are+associated+with+recruitment+and+selection+of+bovine+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Changes in messenger ribonucleic acid encoding luteinizing hormone receptor, cytochrome P450 side chain cleavage, and aromatase are associated with recruitment and selection of bovine ovarian follicles.</a> Biol Reprod. 56 (5), 1158-1168 (1997).</li>
<li>Orisaka, M., Tajima, K., Tsang, B. K., Kotsuji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa-theca+cell+interactions+during+preantral+follicular+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ovarian.+Res%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa-theca cell interactions during preantral follicular development.</a> J. Ovarian. Res. 2 (1), 9(2009).</li>
<li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li>
<li>Kotsuji, F., Kamitani, N., Goto, K., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+theca+and+granulosa+cell+interactions+modulate+their+growth%2C+morphology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bovine theca and granulosa cell interactions modulate their growth, morphology, and function.</a> Biol Reprod. 43 (5), 726-732 (1990).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x ハンクの平衡塩溶液 HBSS (w Mg/Ca、フェノールレッド)</td><td>バイオ&売る</td><td>理学士。L201-10</td><td>超純水に溶かします。消化液(HBSSおよびHEPES)のpHを7.4に調整し、使用前に無菌ろ過を行ってください</td></tr><tr><td>18 G針、40 mm、直径1.2 mm</td><td>ロス</td><td>281T.1</td><td>使い捨て針, ショートカット</td></tr><tr><td>3mlシリンジ(Omnifix Luer)</td><td>ロス</td><td>LY22.1</td><td></td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>メルク</td><td>A6964</td><td>支店:シグマ・アルドリッチ</td></tr><tr><td>アムホテリシンB(250およびマイクロg/ml)</td><td>バイオ&売る</td><td>理学士。AB17.01050</td><td></td></tr><tr><td>アンドロステンジオン</td><td>メルク</td><td>46033</td><td>100%エタノールで希釈した100mMの原液を使用します。支店:Supelco</td></tr><tr><td>双眼鏡 Carl Zeiss Technival2</td><td>カールツァイスイエナ</td><td>該当なし</td><td>入射光 Schott KL 1600 LEDと一緒に使用</td></tr><tr><td>BSA(5%)</td><td>メルク</td><td>A3311</td><td>支店:シグマ・アルドリッチ</td></tr><tr><td>セルストレーナー(100&micro;m孔径)</td><td>ザルシュテット</td><td>83.3945.100</td><td>50ml遠心分離チューブに取り付けます</td></tr><tr><td>コラーゲンR(0.2%)</td><td>セルバ</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼNB8(10%)</td><td>ノードマーク</td><td>S1745601</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX細胞凍結容器&nbsp;</td><td>メルク</td><td>CLS432002</td><td>コーニングの製品</td></tr><tr><td>凍結保存バイアル(2ml)</td><td>TPPファウスト</td><td>TPP89020</td><td></td></tr><tr><td>培養皿, 12ウェル, 平底</td><td>TPPファウスト</td><td>TPP92112</td><td></td></tr><tr><td>培養皿, 24ウェル, 平底</td><td>TPPファウスト</td><td>TPP92424</td><td></td></tr><tr><td>培養皿, 6ウェル, 平底</td><td>TPPファウスト</td><td>TPP92006</td><td></td></tr><tr><td>DMSOの</td><td>ロス</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 無し Ca2+、Mg2+</td><td>バイオ&売る</td><td>理学士。L182-10</td><td>使用前に超純水とオートクレーブに溶かしてください</td></tr><tr><td>エストラジオール、17b-[2,4,6,7-3H]</td><td>ハルトマン・アナリティック</td><td>ART1555</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清(FBS Superior stabil)</td><td>バイオ&売る</td><td>FBSです。S0615</td><td></td></tr><tr><td>FSH(~7,000 IU/mg、ヒト下垂体由来)</td><td>メルク</td><td>F4021</td><td>2 & micro の原液を使用することを好みます。g/ml、0.9%NaClで希釈;支店:シグマ・アルドリッチ</td></tr><tr><td>吊り下げ式細胞培養インサート(0.4 & micro;m孔径)</td><td>セルQART</td><td>9320412</td><td>注文中は、挿入物のさまざまなプロパティに注意してください。位相差顕微鏡検査には透明なPETメンブレンを好みます</td></tr><tr><td>ヘペス (1 M)</td><td>ロス</td><td>9105.2</td><td>消化液(HBSSおよびHEPES)のpHを7.4に調整し、使用前に無菌ろ過を行ってください</td></tr><tr><td>ホロトランスフェリン(牛)</td><td>メルク</td><td>T1283</td><td>滅菌水に溶かします。支店:シグマ・アルドリッチ</td></tr><tr><td>innuPREP RNAミニキット2.0</td><td>ISTインヌスクリーン</td><td>845-KS-2040250</td><td></td></tr><tr><td>インスリン (10 mg/ml、ウシ膵臓由来)</td><td>メルク</td><td>I0516</td><td>1x PBSに溶解します。支店:シグマ・アルドリッチ</td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>バイオ&売る</td><td>理学士。K0283</td><td></td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>メルク</td><td>I1146</td><td>200&microの原液を使用します。g/ml、10 mM HCl および 1x PBS に溶解し、1 mg/ml BSA を添加。支店:シグマ・アルドリッチ</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000分光光度計</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>該当なし</td><td>RNA濃度測定</td></tr><tr><td>NEA(100倍)</td><td>バイオ&売る</td><td>理学士。K0293</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 IU/10 mg/ml)</td><td>バイオ&売る</td><td>理学士。A2213</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養に適した精製水</td><td>メルク</td><td>W3500</td><td>支店:シグマ・アルドリッチ</td></tr><tr><td>SensiFAST cDNA合成キット</td><td>バイオライン</td><td>バイオ-65054</td><td>販売パートナーのBioCatを通じて供給</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム(7.5%)</td><td>バイオ&売る</td><td>理学士。L1713</td><td></td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>メルク</td><td>S9133</td><td>滅菌水に溶かします。支店:シグマ・アルドリッチ</td></tr><tr><td>サーモシェーカー TS-100C</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12357627</td><td>HC18ブロック(カタログ番号12337627)と併用</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>バイオ&売る</td><td>理学士。F0915</td><td></td></tr></tbody></table>

ウシ卵巣における顆粒膜‐テカ細胞相互作用を理解するための改良共培養システム

A Modified Co-Culture System for Understanding Granulosa-Theca Cell Interactions in the Bovine Ovary

TCとGCは、卵胞区画化に基づく確立された機械的分離技術を使用して単離されましたが、クロスコンタミネーションのリスクを排除するために、細胞型特異的遺伝子の発現 CYP17A1 および CYP19A1 が評価されました。 CYP17A1 は新たに単離されたTCでのみ発現し、 CYP19A1 は主に新たに単離されたGCで発現しました(図2)。
共培養システムは、メンブレンインサートの反対側にあるウシテカ細胞と顆粒膜細胞の区画化を可能にし、それによってin vivoの空間組織を模倣します。培養3日後、TCはコラーゲンでコーティングされたインサート膜の表面に広がり、平らで細長い形態を示し、付着が成功したことを示しています(図3A)。9日間全体にわたって単独で培養した場合、TCは増殖し続け、9日目までに合流に達しました(図3B)。対照的に、コラーゲンでコーティングされたインサート膜上で6日間単独で培養されたGCは、in vitroでのGCに特徴的な線維芽細胞様表現型を発達させました(図3C)。さらに、前述のように、GCはクラスターを形成する傾向があり、これは培養におけるこれらの細胞の典型的な特徴である5,7,31,32。共培養システムでは、それぞれの時間一致単一培養と比較して、TCまたはGCのいずれにも明らかな形態学的違いは観察されず(図3D)、インサートベースの環境が正常な細胞挙動を維持していることを示しています。しかし、技術的な制限により、共培養の顕微鏡的評価は、特に他の細胞から独立してTC形態を区別および評価する上で、依然として困難です。これらの制限を克服するために、免疫染色用の細胞特異的抗体がない場合の細胞同定のための代替戦略の探索に従って、細胞固定のための最適化されたプロトコルが現在取り組まれています。
共培養システムの機能は、ホルモン産生とTCおよびGCの主要なマーカー遺伝子の発現を分析することによって評価され33,34、細胞型特異的なステロイド生成の役割が確認されました。GC単一培養モデルと共培養モデルを比較すると、in vitroで生成された同様のエストラジオール(E2)レベルが明らかになりました。しかし、予想通り、TC単一培養は、テカ細胞が独立してE2を合成する能力を欠いていると述べている2細胞-2-ゴナドトロピン仮説(図4A)15と一致して、無視できる量のE2しか産生しませんでした。
培養条件の生理学的関連性をさらに評価するために、主要なマーカー遺伝子33 の発現を調べました。2細胞2ゴナドトロピン仮説に従って、 CYP19A1 は主にGCで発現していましたが、 CYP17A1 は主にTCで検出され、単培養条件と共培養条件の両方で観察されたパターンでした(図4B、C)。特に、エストラジオール濃度に差は観察されなかったにもかかわらず、 CYP19A1 の転写産物存在量は、GC単一培養と比較して共培養システム内のGCで高かった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig1.jpg"> 
図1:細胞培養セットアップの概略図。 (A)最初の培養期間を通じて培地の漏れを防ぐために、逆インサートの切り捨てられたチューブを利用するカスタムビルドの接種チャンバーを示す図。(B)実験手順のタイムライン:TCを逆さまのインサート上で3日間培養し、付着させました。インサートを裏返し、GCを反対側に播種し、さらに6日間培養しました。この研究では、別々に培養された TC と GC を TC-GC 共培養システムと比較しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig2.jpg"> 
図2:新たに単離された顆粒膜細胞およびテカ細胞における細胞型特異的マーカーの遺伝子発現。 (A) CYP17A1 はTCでのみ発現し、(B) CYP19A1 は主にGCで検出され、培養前に単離された細胞集団の特異性と初期純度を確認しました。データは、参照遺伝子 RPLP0 および TBPの幾何平均に正規化された相対発現として表示されます。平均と平均の標準誤差が表示され、データは正規性と分散についてテストされ、アスタリスクは有意差を示します (n=3、t 検定)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig3.jpg"> 
図3:培養中のテカ細胞と顆粒膜細胞の形態。 (A)3日間培養したTCをコラーゲンでコーティングされたインサート膜に結合させた。(B)TCは、単一培養で9日間の期間全体後に合流するまで成長しました。(C)GCは、培養6日後に典型的な線維芽細胞様表現型を示します。(D)TCとGCの共培養は、それぞれの時間一致した単一培養と比較して明らかな形態学的違いを示さない。この画像は、6日間のGC培養と9日間のTC培養後(共培養実験の終点)に撮影されました。スケールバーは100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig4.jpg"> 
図4:共培養システムにおける機能マーカーの分析。 (A)エストラジオール(E2)のホルモン濃度は、細胞培養システムの生理学的機能を確認します。(B、C)TCマーカー CYP17A1 とGCマーカー CYP19A1 の遺伝子発現解析により、両方の細胞集団の同一性と機能状態が実証されます。参照遺伝子 RPLP0 および TBP の幾何平均を使用して、相対発現を計算しました。平均と平均の標準誤差が表示され、データは正規性と分散についてテストされ、アスタリスクは有意差を示します (n=3、一元配置分散分析)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

A reliable co-culture of granulosa (GCs) and theca cells (TCs) has the potential to facilitate a more comprehensive understanding of the interactions, ...

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Research

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