拡張顕微鏡:従来型顕微鏡による高分解能蛍光イメージング
2025年12月19日
ここでは、クライオ固定と拡張顕微鏡法(Cryo-ExM)を組み合わせた詳細なプロトコルを紹介し、さまざまな生物学的サンプルに適応した構造保存と高解像度イメージングを可能にします。生物サンプルは凍結され、膨張性ポリマーに埋め込まれ、変性・拡張・免疫標識処理され、標準的な光学顕微鏡による超分解能イメージングが可能になります。
私たちは細胞生物学者で、微小管の役割と異なるモデル生物におけるそれに関連する機能を調査しています。私たちは、これらの細胞が細胞組織化、形態形成、繊毛形成、分裂に果たす役割を調査することを目指しています。過去5年間で、私たちは膨張顕微鏡の利用を通じて円形分子組成の理解に貢献してきました。
これにより、それらの組み立てと機能の重要な特徴が明らかになります。拡張顕微鏡と凍結固定を組み合わせることで、我々のプロトコルは細胞元素のほぼネイティブ構造を保持しつつ高解像度イメージングを可能にし、超分解能顕微鏡の主な制約を克服します。拡張顕微鏡は低コストで実装が簡単な技術で、すべての研究室で超高解像度にアクセスできるのです。
まず、注射器と針を使って、5ミリリットルのチューブごとに1ミリリットルの余分な乾燥アセトンを化学フードの下に注ぎます。チューブを金属製のラックに立てて置き、液体窒素に入れて冷凍します。厚さ30×30センチの厚いポリスチレン箱の半分にドライアイスを入れ、その後、Vitrobotタイプのデュワーに液体窒素を充填し、蒸発が止まるまで詰めます。
次に、クモを投下装置から外し、金属製の投下チャンバーに液体エタンを注ぎます。エタンが平衡に達するまで10分待ちます。次に、12ミリのカバースリップに細いピンセットをつけてティッシュペーパーに軽くつけ、カバースリップの余分な媒体を吸い取ります。
カバースリップを半分持って、クライオプランジャーに対応したクランプリング付きのピンセットで固定します。カバースリップを固定したピンセットをクライオプランジャーホルダーに入れ、Whatman紙で残った媒体を拭き取ります。クライオプランジャーを作動させ、カバースリップを金属チャンバー内のエタン溶液に浸します。
そして、カバースリップを冷凍アセトン入りのチューブに素早く移します。カバースリップを含むチューブをドライアイスで約45度の角度で孵化させます。密閉容器を50〜100 RPMに設定した軌道シェーカーに置き、4度で一晩攪拌して温度を徐々に上げます。
次に、箱からほとんどのドライアイスを取り出します。軌道シェーカーでさらに45分間攪拌を続け、温度をマイナス80度からマイナス20度まで上昇させてください。各チューブを短く開閉して内部圧力を解放します。
その後、各カバースリップを12ウェルプレートまたは、事前に冷却された100%エタノール溶液で満たされた適切な容器に移します。5分間の培養後、カバースリップをグレードされたエタノールシリーズに再水和させます。カバースリップをPBSに転写した後、顕微鏡で観察します。
細いピンセットで表面を優しく引っかき、カバースリップの正しい面が上を向くように配置します。カバースリップを、2%アクリルアミドと1.4%ホルムアルデヒド溶液をPBSに入れた0.5〜1ミリリットルの4ウェルプレートに置きます。その後、この溶液で37度の温度で攪拌せずにカバースリップを孵化します。
次に、10%APSとゲル化液を氷で10分間解凍してからゲル化します。薄い湿ったティッシュとパラフィルムを用いて湿ったチャンバーを準備します。その後、4度で保存します。
10分後、湿ったチャンバーを冷たいブロックの上に置き、ゲーションの際に使います。次に、タンパク質の固定液からカバースリップを取り除き、ティッシュペーパーで余分な液体を2回連続で拭き取ります。ゲル化液にAPSを加えて最終濃度0.5%にし、2〜3秒間渦を巻きます。
次に、湿ったチャンバーのパラフィルムに35マイクロリットルの滴を2滴ピペットし、それぞれのカバースリップを優しく滴の上に置き、細胞はゲル化溶液の中に下向きに向きます。湿ったチャンバーを37度のインキュベーターに30〜60分間移します。変性の場合は、直径0.4センチの生検パンチツールを使ってゲル片を抽出し、1ミリリットルの変性バッファーを入れた6ウェルプレートに置きます。
プレートを10〜15分間攪拌し、ゲルがカバースリップから剥がれるまで続け、剥離したゲル片を新鮮な変性バッファーを入れた1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。ゲルを95度の温度で90分間孵化します。孵化後、ゲルを二重蒸留水に10分間移して洗浄します。
ゲルの直径をミリペーパーで測定し、ゲル膨張率を評価します。カバースリップは約200マイクロリットルのポリリシン溶液でクリーンに塗ります。カバースリップを室温で1時間孵化し、その後二重蒸留水で3回洗って過剰なポリリジンを取り除きます。
カバースリップが乾いたら、さらに使用するまで4度の温度で保存してください。ゲルを適切な向きに、細胞が上を向くようにして、糸くずのない紙の上に置き、余分な水分を取り除くために乾かします。最後に、乾燥ゲルを細胞を下向きにしてポリ-D-リジンコーティングされたカバースリップに取り付けます。
クライオフィクシングは、NHSエステルおよびATP5A染色で示されるように、PFA固定よりもRPE1細胞内のミトコンドリアネットワークをより効果的に保存し、PFA固定では見えなかったミトコンドリアクリステアの解像を可能にしました。クライオフィクセーションはPFA固定に比べて、有糸分裂RPE1細胞における細胞質および星体微小管を含む動的微小管の保存が良好に行われました。トリパノソーマ・ブルーシーのクリオフィクシーは、PFA固定に比べてミトコンドリアの構造や一般的な細胞構造をよりよく保存し、TDHおよびNHSエステル染色で可視化されました。
さらに、凍結固定はBIP染色に基づくPFA固定よりも内質網をよりよく保存しました。凍結されたRPE1細胞では亀裂が観察されましたが、これらはミトコンドリアや微小管などの小器官の超構造を破壊するものではありませんでした。凍結固定不良は、気泡状構造や波状微小管、そして膜質小器官の完全性喪失によって示されました。
膨張品質はアクリレートナトリウム溶液の透明度に依存し、利用可能な溶液は無色またはやや黄色く半透明に見え、使えない溶液は濁ってオレンジ色に見えました。
概要
この研究は、生物学サンプルの高解像度イメージングのためにクライオ固定と拡張顕微鏡法（Cryo-ExM）を組み合わせたプロトコルを提示しています。この方法は細胞要素の近自然構造を保持し、標準的な光学顕微鏡による超解像度イメージングを可能にします。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 顕微鏡技術
- 構造生物学
背景
- 微小管は細胞の組織化と機能において重要な役割を果たします。
- 拡張顕微鏡法は分子組成の研究に使用されてきました。
- クライオ固定は従来の方法と比較して細胞構造の保存を強化します。
- 超解像度顕微鏡技術は構造保存に制限があることがよくあります。
研究の目的
- クライオ固定と拡張顕微鏡法を組み合わせたプロトコルを開発すること。
- 細胞構造の高解像度イメージングを可能にすること。
- イメージング中の動的な微小管とオルガネラの保存を改善すること。
使用した方法
- クライオ固定を用いた生物学サンプルの準備。
- 拡張顕微鏡法のための膨張性ポリマーへのサンプルの埋め込み。
- 特定の細胞成分を可視化するための免疫ラベリング。
- イメージングのための標準的な光学顕微鏡の使用。
主要な結果
- クライオ固定はPFA固定よりも効果的にミトコンドリアネットワークを保存しました。
- 動的な微小管がより良く保存され、詳細なイメージングが可能になりました。
- ミトコンドリアや小胞体を含むオルガネラの構造が維持されました。
- クライオ固定細胞の亀裂にもかかわらず、構造的完全性が観察されました。
結論
- Cryo-ExMプロトコルは高解像度イメージングのための信頼性の高い方法を提供します。
- 従来の超解像度顕微鏡の限界を克服します。
- この技術は様々な研究室にとってアクセス可能で費用対効果が高いです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Expansion microscopy with cryo-fixation enables nanoscale imaging of cellular structures using standard fluorescence microscopes, overcoming the resolution and preservation limitations of conventional super-resolution methods. This capability supports early discovery and target validation by providing high-fidelity visualization of organelles and cytoskeletal elements in near-native states. The approach enhances predictive confidence in structural biology workflows and broadens access to advanced imaging for diverse R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of subcellular architecture relevant to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by preserving dynamic structures such as microtubules and organelles.
- Facilitates mechanistic de-risking through artifact-minimized imaging of cellular assemblies.
- Improves predictive confidence for downstream biological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, high-resolution biological systems for quantitative imaging assays.
- Standardizes sample preservation and expansion for reproducible assay outputs.
- Enables scalable imaging workflows using conventional confocal platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on cellular ultrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular phenotypes in preclinical models.
- Maintains translational continuity by minimizing fixation artifacts across sample types.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on high-resolution structural data.
- Provides mechanistic insights into organelle and cytoskeletal dynamics relevant to therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, enabling high-resolution imaging without specialized nanoscopy infrastructure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing native cellular structures.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides measurable expansion factors and structural readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures continuity of structural data from cell lines to whole organisms.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly accessible, cost-effective imaging capability for multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-fixation, hydrogel embedding, and fluorescence imaging.
- Needs access to confocal or widefield fluorescence microscopes and basic cryo-infrastructure.
- Demands cross-team standardization of fixation and expansion protocols for reproducibility.
- Adaptable to a range of model systems, from cultured cells to whole organisms.
- Expansion quality depends on reagent clarity and precise handling, as supported by source observations.
