げっ歯類の脳微小血管系の超解像マッピングのための超音波局在顕微鏡

私たちの研究は、脳の微小血管構造と流れを特徴づけ、超分解能超音波手法の改良を目指しています。最近の開発により、マイクロバブル追跡の最適化や処理パイプラインの強化により、ULMを用いた超分解能血管マッピングのためのより安定したプロトコルが作成されています。まず、麻酔をかけたマウスを立体型フレームに置き、温熱パッドを37度に設定します。

しっかりとしたが損傷を与えない圧力で、つま先や尾をつまんで反射がないか確認し、十分な麻酔深度を確認します。施術中に両目に眼軟膏を塗布し、眼の潰瘍や白内障の形成を防ぎます。次に、トリマーでマウスの頭を剃ります。

除毛クリームを塗りましょう。1〜1.5分ほど置き、その後ぬるま湯でしっかりすすいで、ガーゼで乾かします。次に、遠心分離した超音波ジェルをヘッドに塗布し、音響結合を確保します。

尾部静脈カテーテル治療には、27ゲージの半インチ翼状注入セットを、8インチのチューブ付き18ゲージのハーフインチ針に接続します。可能であればチューブを短くして、デッドボリュームを最小限にしましょう。尾を優しく90度回転させて側尾の脈を露出させます。

その後、尾をテープで固定し、安定性を保ち、カテーテル挿入中の動きを防ぎます。さて、尾動脈を特定してください。静脈の視認性を改善するために、尾をぬるま湯で温めて血管拡張を促進します。

指で尾の付け根に優しく圧力をかけ、血流方向に逆らって注射部位に滑らせます。針を静脈に平行に、ベベルを上に向けて挿入します。針の正しい位置を確認するために、血流フラッシュバックの検査を観察してください。

画像システム上で機能的超音波取得ソフトウェアを起動し、新しい実験セッションを作成します。超音波プローブの位置を調整してください。次に、ソフトウェアでライブビューの取得を開始し、パワードップラーイメージングを使ってプローブをリアルタイムで調整して脳を画面の中心に合わせます。

コントラストや圧縮などのイメージングパラメータを最適化し、可視化の品質を向上させます。次に、取得ソフトでAngio 3Dメニューを開きます。スキャンパラメータを調整して脳全体を完全に覆い、スキャン取得を開始します。

取得ソフトウェアを開いたままにし、Angio 3Dが終わったら、分析と可視化のためにIcoStudioのソフトウェアを起動してください。血管造影3Dスキャンをレビュー用に読み込みます。脳登録パネルに移動し、完全自動または手動モードのいずれかでアンジョニック3Dスキャンを登録してください。

完了した登録をBPSファイルとして保存してください。次に、Brainナビゲーションメニューを開き、アトラスマネージャーパネルまでスクロールしてください。親ツリーナビゲーターを使ってAllen Mouseの脳アトラスを閲覧し、3ビューパネルで重ねるための希望の解剖学的領域を選択します。

選定された関心領域と重なるイメージング面を選びます。コロナビューでは、目的のイメージングスライスを定義するために手動で2つのマーカーを配置します。次に、BPSの位置決めをクリックして、選択したイメージング面のモーター座標を抽出します。

アングルジョ3Dスキャンの画像プレビューを確認し、「BPS座標をコピー」をクリックしてください。IcoScanソフトに切り替え、Moveプローブパネルを開きます。ニューロナビゲーションをクリックし、コピーした値を貼り付けると、システムがプローブを選択したイメージング面に自動的に整列させます。

その後、現在のイメージング面が選択された面と一致しているか確認するためにライブイメージングを開始します。滅菌注射器を使い、0.9%塩化ナトリウム溶液を5ミリリットル、超音波造影剤マイクロバブルバイアルに鼻中隔から注入します。バイアルを20秒間激しく攪拌して微小気泡を再浮遊させ、均一な分散を確実にします。

超音波シーケンス、フレームレート、総録画時間などの録画パラメータを事前に定義します。その後、注入用のマイクロバブルの必要な体積を抽出し、取得を開始します。取得が始まったら、適切な希釈でマウスに100マイクロリットルを注入します。

ライブビジュアライゼーションパネルでコントラスト強化を確認してください。すぐにカテーテルに生理液を注入して、死んだ体積に残った微小気泡を洗い流してください。取得が完了するのを待ち、記録されたデータを保存してください。

Icolabソフトウェアを開き、「超音波の位置特定顕微鏡」タブをクリックします。次に、「ULMマップの計算」をクリックして処理ワークフローを開始します。以前に取得したデータを含むソースフォルダーを選択します。

次に、処理する特定のスキャンファイルを選択し、必要に応じて処理時間の境界を調整します。「次」をクリックして報告ステップに進みます。処理済みファイルを保存するための出力フォルダパスを設定し、レポート画像の可視化パラメータを設定します。

次に「実行」をクリックしてデータの処理を開始します。完成後、局所化されたマイクロバブル座標を含むTRKファイルと、密度、速度、後方散乱振幅を表すTIFFファイルが作成されます。TRKファイルをIcoStudioに読み込み、処理済みデータの探索を開始します。

その後、IcoStudioの右側パネルを使って、コントラスト、圧縮、カラーマップなどの可視化パラメータを調整し、データ表現を強化します。積分時間を設定するには、メインビューの下部にあるダブルスライダーを調整して解析の開始フレームと終了フレームを定義します。密度タブはマイクロバブル発生の分布を示しています。

絶対密度と方向密度のどちらかを選びましょう。その後、Velocityタブをクリックすると、絶対、方向、軸方向、横方向の各モードでミリメートル毎秒のマイクロバブル速度を表示します。画像の鮮明さを向上させるためにコントラスト、圧縮、速度の閾値を調整してください。

その後、「後方散乱振幅」タブを探索してマイクロバブルの反射率を確認し、コントラストを高め、微小血管構造や面外運動を明らかにします。高解像度のPNGとして画像をエクスポートしたり、ピクセルサイズをカスタマイズ可能な定量分析用のTIFFファイルを生成したりできます。ULMで取得した冠状ラット脳スライスのマイクロバブル密度マップは、大きな血管と微細な毛細血管構造の両方を解明し、分岐や分岐パターンを含む詳細な血管トポロジーを明らかにしました。

同じ脳スライスの速度マップでは、上向きの流れが静脈排出、下向きの流れが動脈灌流に対応し、既知の皮質血管構造と一致する明確な軸方向の流れが示されました。後方散乱振幅マップは深さ依存のコントラストを提供し、標高位置に基づいて船舶を強調表示し、面外や低振幅の船舶のセグメント化に有用でした。同じマウスで弱い位置で取得した血管密度マップは強い空間的重なりを示し、脳位置定位システムを用いたコロナ面ターゲティングの再現性を裏付けました。

セッションを通じた左側体性感覚野の定量解析では、血管半径、速度、流量に類似した分布が見られ、測定の再現性が示されました。同様の再現性は左視床領域でも観察され、第1週から第2週のセッション間で血管半径、速度、流量の値が一貫していました。この研究は、超音波局在顕微鏡が生体内で微小血管構造と流れの超分解能マップを確実に生成できることを確立しました。

このプロトコルは、専用の機能的超音波システムを用いて生きている齧歯類における堅牢なULM取得を可能にする標準化された手順のニーズを満たします。