吸収分子を用いたEx vivo および In vivo イメージングのためのトランジェント光学クリアリング

この研究は、ex vivo 組織と生きた動物の両方で生物医学イメージングを強化するための非侵襲的戦略として、吸収分子を使用した組織クリアリングを評価および実装することを目的としています。私たちは、食用色素タートラジンを使用して、組織と生きた動物の両方で迅速かつ可逆的な光学的透明化を達成し、イメージングの深度と鮮明さを大幅に向上させることが実証されました。当社のプロトコルは、分子を観察することにより、過渡光学クリアリングの再現性における重大なギャップに対処し、高度な計算視覚化技術を組み込んで特徴の可視性を高めます。

吸収分子による組織浄化のための詳細なプロトコルを提供することにより、私たちの研究は、より広範な生物学および生物医学画像研究コミュニティがこれらの方法を独自の研究に適用するのに役立ちます。私たちの研究室は、光と組織の間の物理的相互作用を探求し、利用可能な材料の範囲を拡大し、最適化された光学イメージングプラットフォームを開発することにより、この技術を進歩させてきました。まず、タートラジン染料粉末の必要質量を計算して、目的の溶液量を調製します。

計算された量の染料粉末を清潔なガラスバイアルに移します。容量ピペットを使用して、精度を維持するために必要な量の脱イオン水をバイアルに加えます。染料が室温で完全に溶解しない場合は、ガラスバイアルを摂氏40度に予熱した実験室のオーブンに10分間、または完全に溶解するまで入れます。

次に、染料溶液を30秒から1分間渦にして、完全に溶解させます。ex vivo組織の場合、鶏の胸肉組織をコラーゲン線維と平行な方向に希望の厚さにスライスし、スライスした組織を水で優しく洗浄します。2つのきれいな顕微鏡スライドの間に組織を置き、厚さを測定します。

スライドをそっと押し合わせ、バーニア口径を使用して組織の中心での距離を測定します。次に、準備した染料溶液に組織を浸します。そして、容器をオービタルシェーカーの上に置き、毎分100回転で10分間振とう。

清潔な鉗子を使用して染料溶液から組織を取り除きます。サンプルを 2 枚の透明なスライドガラスの間に置き、適切な解像度と倍率に設定されたデジタルカメラまたは科学カメラを使用して画像をキャプチャします。外部光の干渉を最小限に抑えるために、制御された光環境でイメージング プロセスを実行します。

光透過率を測定するには、準備したサンプルを紫外可視近赤外分光計に入れます。測定の一貫性を維持するために、システムが適切にベースライン化されていること、および染料溶液による処理の前後に光線が同じ組織領域を通過することを確認します。手順では、麻酔をかけた動物を摂氏37度で焼き戻した加熱パッドの上に置きます。

小動物のバリカンを使用して、目的のイメージング領域から毛皮をトリミングします。トリミングした部分に脱毛クリームを60秒以内に塗布して残った毛を取り除き、すぐにクリームを取り除きます。刺激を防ぐために、アルコールワイプを使用して皮膚をきれいにします。

イメージングセットアップを準備するには、低体温症を防ぐために摂氏37度に設定された加熱パッドを動物の下に置きます。光源とカメラを位置合わせして、高品質の画像をキャプチャします。0.65モルのタルトラジン溶液を0.3%〜0.4%のアガロースゲルと混合して塗布します。

スポイトを使用して、実験に応じて、準備した溶液を腹部または頭の皮膚に塗布します。溶液を数秒間放置して吸収を開始します。次に、綿棒で塗布領域を優しくこすり、溶液を均一に分散させ、皮膚の吸収を高めます。

次に、清潔な綿棒でその部分を優しくマッサージし、必要に応じてさらに溶液を塗布します。オレンジ色の赤い点が徐々に均一な色に融合し、染料の浸透が成功し、光学的クリアリングが開始されたことを示します。皮膚が透明になり、内臓が見えるまでマッサージを続けますが、通常、小さな領域で約3〜5分かかります。

スライドガラスまたはカバースリップを皮膚の上にそっと置き、表面の輝きを軽減し、反射を最小限に抑えます。水で湿らせた綿棒または柔らかい布を使用して、染料溶液を皮膚から優しく取り除きます。光学的クリアリング効果が逆転し、皮膚は徐々に元の不透明な外観に戻ります。

ガス麻酔を止めた後、動物が意識を取り戻すのを待ちます。動物が完全に目覚めて動いたら、ホームケージに戻します。未処理のex vivo鶏胸肉組織では、根底にあるパターンは見えず、分光計データは、組織の厚さの増加とともに減少する低い透過率を示しました。

0.65モルのタートラジン溶液で処理した後、組織は目に見えて透明になり、下にあるグリッドとロゴのパターンがはっきりと現れました。可視スペクトルのすべての厚さにわたる透過値の大幅な増加も観察されました。生きたマウスでは、0.65モルのタートラジン溶液を適用すると、治療後数分以内に皮膚を通して内臓を視覚化することができ、腹部の透明性が目に見えて向上しました。

頭皮の光学的クリアリングにより、皮膚を外科的に除去することなく脳血管を視覚化することができ、脳イメージングに対するこの技術の有効性が実証されました。クリアリング効果は完全に可逆的でした。組織を水ですすぐと、数時間以内に不透明度と正常な皮膚の外観が回復し、数日間にわたって毛の再生が観察されました。