マウスにおける最適化された低侵襲経強膜網膜下注射技術

網膜下注射は、遺伝性網膜疾患の治療法の前臨床調査のための重要なツールです。このビデオでは、マウスに最適化された低侵襲網膜下注射技術を紹介します。経強膜網膜下注射は、光受容体と RPE に材料を送達する優れた方法です。

ただし、この手法は技術的に困難であり、再現性とアクセシビリティを高めるために最適化されたプロトコルを開発する必要があります。私たちの改善には、マウスまぶたの検鏡の開発、アトロピンの術前投与、ダイヤモンドナイフを使用したピンポイント強膜切開術の作成、針のサイズと注射アプローチの最適化が含まれます。私たちの方法の一貫性、再現性、優れた形質導入範囲、および最小限の外科的損傷により、科学界への網膜下注射のアクセシビリティが向上することを願っています。

当社の最適化により、マウスでの網膜下注射の実施が簡単かつ迅速になり、実験のばらつきが減り、注射の成功率が向上します。この技術は、将来の前臨床トランスレーショナル網膜研究を促進します。まず、網膜下注射を行う30分前に、アトロピンを1キログラムあたり1ミリグラムを総量50マイクロリットルの腹腔内投与します。

ガラスマイクロニードルに希望の量の注射液をロードします。針をマイクロインジェクターに取り付け、毛細管現象を打ち消すために補償圧力を5ヘクトパスカルに設定します。麻酔をかけたマウスを解剖実体顕微鏡下に置きます。

局所麻酔を達成するために、0.5%プロパラカインを眼に一滴塗布します。0.2% シクロペントレートと 1% フェニレフリンを含む混合物を一滴眼に塗布して、網膜下水疱の術後イメージングのために瞳孔を拡張し、術中の出血を減らします。カスタムのミニチュアワイヤー検鏡を使用して、上円蓋を露出させ、検鏡を固定して、ハンズフリーで上まぶたを引っ込めることができます。

角度の付いたヴァンナスハサミを使用して、上結膜とテノン嚢の輪部から約1ミリ後方に輪部切開を行い、上強膜を露出させます。注射部位のテノンカプセルの残りを慎重に取り除きます。次に、結膜腹切開術と腱切開術の前縁をロック歯付き鉗子でつかみます。

次に、上強膜を露出させるために、地球をそっと下に導管します。バランス緩衝生理食塩水をすぐに目に一滴塗布して、裸の強膜に水分を補給し、より大きな光学倍率を実現します。ダイヤモンドナイフを使用して、輪部から約12時と1〜2ミリメートルの位置でピンポイントの強膜切開を行います。

強膜切開術が小さく浅いようにブレードを強膜に接線方向に配置します。手術用スポンジを使用して、バランスのとれた緩衝生理食塩水を目の表面からすべて優しく取り除きます。針の面取りを強膜に対して浅い角度で押さえ、先端をゆっくりと強膜切開術に挿入し、網膜を貫通せずに網膜下腔にアクセスするためにわずか0.5〜1ミリメートル前進させます。

針を安定させながら、フットペダルを使用して500ヘクトパスカルで注入を開始し、15秒間連続圧力を維持します。針を取り外し、強膜切開部位を通る注入された溶液の部分的な逆流を観察し、網膜下腔が注入された溶液の全量を収容できないため、送達が成功したことを示します。追加の逆流を避けるために、地球に圧力をかけずに、ロック鉗子とまぶたの検鏡を慎重に取り外します。

注射直後に、網膜下水疱の視覚化を助けるために、潤滑剤の眼軟膏をたっぷりと目に塗布します。経強膜注射直後のOCTでは網膜下水疱がはっきりと見え、分娩が成功したことが確認されました。網膜色素上皮 (RPE) を評価するために、AAV-8 ジストロフィン 1-GFP を標的とすると、上皮層全体に広範囲に緑色の蛍光が発表示され、経強膜アプローチを使用した効率的かつ広範な RPE 形質導入が示されました。

AAV-8ロドプシンGFPは、桿体光受容体に強い緑色の蛍光シグナルをもたらし、断面図と眼底図の両方で見ることができ、光受容体細胞でのターゲティングと発現が成功していることを示しています。AAV8-CAG-mCherryは、網膜層全体に広い赤色蛍光を発し、特定の細胞型を超えた一般化された導入遺伝子発現をサポートするこの技術の能力を実証しました。網膜溶解物のウェスタンブロッティングは、注射水疱の中心に対応する最高レベルの強力な緑色蛍光タンパク質発現も示し、AAV8ロドプシンGFPによる光受容体形質導入を検証しました。

網膜切片の免疫蛍光分析を用いたAAV力価最適化により、標的細胞の約90%の形質導入を達成するウイルス力価の選択が可能になります。例えば、この場合、AAV8ロドプシンGFPウイルスストックの1〜10希釈は、ほとんどすべての光受容体で導入遺伝子発現を生じた。対照的に、1〜100の希釈では形質導入速度が不十分でした。

網膜電図は、経強膜注射が正常な網膜機能を維持する一方で、経網膜注射がA波およびB波の反応を大幅に低下させ、網膜損傷を示すことを示しました。