Name: 同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶ 同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡（SLAM）を用いた非線形光学顕微法。4チャンネルの同時検出により、生体組織の微小環境を無標識で詳細に解析し、神経科学やがん研究への応用を可能にします。

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非線形光学顕微鏡は、強い光放射(電界が3 × 103 V / cmを超える光)に対する標本の応答を利用して画像のコントラストを導き出し、誘導偏光(したがって生成される信号)は入射強度1,2,3に非線形に依存します。これらの複数のコントラストはそれぞれ異なる光と物質の相互作用によって媒介されるため、非線形顕微鏡は、試料1,2,3の形態と化学的景観の両方に関する固有の情報への同時アクセスを提供します。照明光との線形相互作用を伴う従来の顕微鏡技術は定量的イメージングも可能になりますが、非線形顕微鏡はよりマルチモーダルなアプローチを可能にし、多くの場合、イメージング深度と光学セクショニングを改善しながら、サンプルへの光損傷も少なくします4。組織の術中組織学様評価などの生物医学的応用の文脈では 5,6、この技術により、天然生体分子の直接プロービングが可能になり、外部マーカーや修飾を必要とせずに生細胞のシームレスな調査が容易になります。このアプローチは、タグ、ラベル7、外因性分子、遺伝的に発現した蛍光タンパク質、またはナノ粒子の使用を回避し、これらは多大な労力を必要とするだけでなく、標本の本来の生化学を破壊し、標的細胞または組織に悪影響を与える可能性があります8,9,10.したがって、非線形顕微鏡は、試料の化学的および構造的完全性を変えることなく、微視構造の連続イメージングを提供する強力で本物の分析ツールとして機能します。この機能により、診断や創薬から細胞シグナル伝達やシステム生物学に至るまで、幅広いアプリケーションが開かれます。
2 光子自家蛍光 (2PAF)、3 光子自家蛍光 (3PAF)、第 2 高調波発生 (SHG)、第 3 高調波発生 (THG) などの多光子コントラストは、それぞれサンプルの特性評価において分析上の利点をもたらします。2PAFは内因性フラビンによって生成され、フラビンアデノシンジヌクレオチド(FAD)は生物学的システムで最も豊富です11。3PAFは、近赤外励起を利用してNAD(P)Hなどの固有の発色団を視覚化し、UV関連の光毒性と減衰の問題を回避しながら代謝イメージングを可能にします12。SHGは、線維性コラーゲン(タイプI、II、およびIII)やタンパク質配列13、14、15、16、17などの非中心対称分子構造を具体的に明らかにし、構造的洞察を提供します1。最後に、THGは界面や小さな構造的特徴に敏感で、脂質分布と細胞外小胞のイメージングに優れています18,19,20,21,22。
これらのコントラスト信号のそれぞれは、研究グループによって独自に調査されており、生物学的応用のための信頼性が高く用途の広いツールとして多光子非線形顕微鏡のニッチを確立しています23,24,25,26。これらの取り組みは、2PAF顕微鏡の発明者によって先頭に立って行われ、革新的な技術を活用して、組織の形態、細胞代謝、さらにはアルツハイマー病や癌などの病状の形態機能的特徴について新たな洞察を得ました23。彼らの研究は最終的に神経科学における画期的な応用を推進しました27,28。その後の数年間で、何人かの研究者が、細胞に構造的サポートを提供し、癌の病因の間に実質的な変化を受ける足場である細胞外マトリックスの変化に対するSHGの感受性を強調しました29。特に、Campagnolaら14,24,30,31は、SHG顕微鏡により高分子および超分子アセンブリの視覚化が可能になり、従来の蛍光ベースの技術では検出できなかったコラーゲンの配置、濃度、種類などの詳細が明らかになることを実証しました。これらの結果は、臨床現場で実行可能な診断ツールとしての SHG 顕微鏡の可能性を強調しました。最後に、THG顕微鏡を適用して、げっ歯類の網膜層を細胞内分解能で視覚化することに成功しました25、脳構造をマッピングし32、および黒色腫細胞浸潤の多界面トポグラフィーをキャプチャしました33。
非線形顕微鏡のこれらの歴史的な実装は、一般に、非線形信号を生成および収集するために、高開口数(NA)対物レンズに結合されたモードロックフェムト秒(fs)レーザーを含み、次にダイクロイックミラーでバンドパスフィルターに向けられ、光電子増倍管(PMT)34で収集されました。同様の実装にもかかわらず、ほとんどのアプリケーションは、他のコントラストを無視して、1 つ、または最大で 2 つのコントラストのみを取得することに重点を置いていました。多光子顕微鏡の可能性を最大限に引き出すために、Boppartらは最初に複数の非線形コントラスト21、35、36、37の逐次取得を実装し、続いてそれらの同時検出4,22,38,39,40,41を実装しました.得られた技術は、同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡として知られ、シングルショット励起と多重検出を通じて非線形2PAF、3PAF、SHG、およびTHG信号を空間的および時間的に共登録し、それによって優れた分析能力を実現します。これら4つのチャネルの時空間共局在化は、高度にランク付けされた特徴豊富なデータ42を提供し、モーションアーティファクトを排除し、画像レジストレーションの改善を保証することにより、順次取得されたデータよりも利点を提供します。その結果、SLAMは、代謝特性を効果的に特徴付ける光還元酸化比などの複合特徴の生成を可能にします43,44,45。さらに、モダリティ間での信号の複合分析により、チャネルの相関と共局在化に基づく追加機能のエンジニアリングが容易になります。たとえば、Shiらは、医薬品製造に使用されるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を正確に分類する際のSLAM顕微鏡の共局在化機能の重要性を実証しました42。このようにして、SLAMは、現在多光子顕微鏡の最先端と見なされているものの基礎を築き、この分野の将来の進歩への道を切り開きます46。
このプロトコルでは、SLAM顕微鏡の主要コンポーネント(図1)を概説し、その実装のための段階的な方法論について説明します。これには、励起パルスの生成と整形、代表的な組織標本の調製、イメージング手順、処理、および結果データの表示が含まれます。既製の技術と確立された技術を利用することで、このプロトコルは普遍的で転送可能であり、異なる研究室間で同様の光学システムを使用して簡単に再現できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg"> 
図1:同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡の光学設計。 フェムト秒レーザーは、10 MHz の繰り返し速度で 370 fs パルスで 1040 nm の光を出力します。レーザーの強度と偏光は、フォトニック結晶を励起して超連続体を生成する前に慎重に制御されます。次に、パルスはパルスシェイパーによって圧縮され、カスタマイズされたレーザー走査顕微鏡(破線のボックス)に向けられます。ダイクロイックミラーとバンドパスフィルターは、光電子増倍管(PMT)やハイブリッド光検出器(HPD)などの高感度光子検出器で検出される前に、サンプルによって生成された非線形信号を分離します。光学設計は、前述のシステム41に基づいている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>3軸ステージ</td><td>ソーラボ</td><td>MAX316</td><td>中止。</td></tr><tr><td>35mmガラス底イメージングディッシュ</td><td>マットテック</td><td>P35G-0-14-C</td><td>コーティングされていない#0カバーガラス。</td></tr><tr><td>DMEMの</td><td>ギブコ</td><td>21063029</td><td>高グルコース、HEPES、フェノールレッドなし。</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地サプリメント</td><td>プロモセル</td><td>C-39210型</td><td>子牛胎児血清を省略します。</td></tr><tr><td>フェムトトレインフェムト秒レーザー</td><td>スペクトル物理学</td><td>1040-5</td><td>平均出力:>5.0 W、パルスエネルギー:>500 nJ、波長:1040 nm&plusmn;8 nm、繰り返し速度:10 MHz、パルス幅(FWHM):<220 fs。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サイトバ</td><td>SH30071.03</td><td>HyCloneの特性評価</td></tr><tr><td>ファイバーストリッパー</td><td>ソーラボ</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩水和物</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F6625</td><td></td></tr><tr><td>検流計ミラー</td><td>ケンブリッジテクノロジー</td><td>6215H</td><td>中止。</td></tr><tr><td>ガラス加工ワークステーション</td><td>ヴィトラン</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>イメージJ</td><td>ウィスコンシン大学マディソン校のエリセイリ研究室</td><td>バージョン 2.16.0</td><td>フィジーの分布。</td></tr><tr><td>キムワイプティッシュペーパー</td><td>キンバリー・クラーク・プロフェッショナル</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サイトバ</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ステージ</td><td>応用科学機器</td><td>FTP-2050型</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ステージコントローラー</td><td>応用科学機器</td><td>MS-2000-500-UDSWシリーズ</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡用自己相関器</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>カルペ</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>オリンポス</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>水浸、倍率25倍、1.05NA。</td></tr><tr><td>光パワーメーター</td><td>ニューポート</td><td>919P-003-10</td><td>600 - 1700 nm。</td></tr><tr><td>光スペクトラムアナライザ</td><td>ソーラボ</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>フォトニック結晶ファイバー</td><td>NKTフォトニクス</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>モード領域が大きく、偏光が維持されます。コア直径:15&μ;m。</td></tr><tr><td>精密光ファイバー包丁</td><td>藤倉</td><td>CT-101</td><td></td></tr><tr><td>パルスシェイパー</td><td>バイオフォトニクスソリューションズ株式会社</td><td>フェムトジョック-D</td><td>中止。</td></tr><tr><td>&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元二ナトリウム塩水和物</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡

Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic Microscopy

SLAM顕微鏡の複雑なマルチチャネル、マルチモーダルアプローチ(図1)により、新規ユーザーが問題のトラブルシューティングや結果を理解することが困難になる場合があります。まず、よく切断されたPCFは、PCFの長さに垂直な平らな表面を持つきれいな面(図2C)を特徴としています(図2A)。角度の付いた欠けた劈開面(図2B)と傷の存在(図2E)は、劈開不良を示しています。 図2D に示すPCFの表面の汚れや破片は、切断後のPCFの切断不良または不適切な取り扱いを示しています。最も重要なことは、空気穴のハニカムパターンに囲まれた小さな中央領域であるPCFのコアには、切断が成功すると破片や傷があってはなりません。とはいえ、特にPCFの外側のクラッディングに小さな傷やいくつかの破片が見られるのは正...

Nonlinear optical microscopy images biological samples by detecting signals from the nonlinear interaction of ultrashort laser pulses with endogenous ...

simultaneous-label-free-autofluorescence-multi-harmonic-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる...

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同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡

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