同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡

同時ラベルフリー自家蛍光多調波顕微鏡法(SLAM顕微鏡法)は、光との非線形相互作用を測定することにより、生体サンプル中の固有の情報を捉えます。私たちの研究室では、この技術を使用して、生命と病気を微視的なスケールで研究しています。私たちは、ラベルフリーのマルチモーダルイメージングへの移行を観察し、毒性を回避し、モダリティ間で補完的なコントラストと相関を可能にすると同時に、細胞および組織の構造とダイナミクスに関するより豊富な洞察を提供します。

最先端のラベルフリー非線形顕微鏡は、一度に1つの信号を取得するため、ミスアライメント、光損傷、および多くの同時プロセスのリスクがあります。SLAMは、厳密に共同登録されたマルチモーダルコントラストを可能にすることでこれらの問題を克服し、信頼性の高い空間的および時間的データを保証します。この技術により、多光子顕微鏡で4つのチャネルの励起と検出を同時に行うことができます。

フォトニック結晶ファイバーを使用して、SHG、THG、および2光子および3光子蛍光のパルスを広げます。SLAMは、アライメントアーティファクトや外因性標識なしで、多重化された代謝構造および動的細胞シグナル伝達情報をキャプチャし、標準化された定量的組織分析を可能にします。その応用は、基礎生物学、トランスレーショナルリサーチ、腫瘍学、神経変性、組織再生におけるバイオマーカーの発見に及びます。

まず、分光計または光スペクトラムアナライザを使用して、放物面鏡の後のレーザーを測定し、フォトニック結晶ファイバーの超連続体生成を検証します。偏光ビームスプリッターの後の中間プレートを回転させて、スーパーコンティニューマの幅を最適化します。顕微鏡用自己相関器をオンにします。

ソフトウェアで、検出器を内部検出器に設定し、スキャン範囲を5ピコ秒に調整して、パルス自己相関の全幅をキャプチャします。レーザーのブロックを解除し、信号が表示されるまでパルスシェイパーから出るビームに自己相関器を合わせます。シャッター2が閉まっていることを確認します。

次に、水や油などの適切な浸漬媒体を対物レンズに適用します。自己相関器の外部検出器を顕微鏡ステージに置き、対物レンズの真上に配置します。次に、走査検流計ミラーをオンにして、電圧を 0 に設定します。

シャッターを開き、蛍光ターゲットを使用して、ビームが外部検出器に到達することを確認します。自己相関器検出器を外部検出器に設定します。次に、信号が表示されるまでステージの位置を調整します。

パルスシェイパーの多項式係数を調整して、自己相関器によって測定されたパルス幅を反復的に最小化します。パルス幅が小さくなると、それに応じてスキャン範囲を縮小して、自己相関関数の精度と視覚化を向上させます。フォトニック結晶ファイバーへのレーザー入力がブロックされていることを確認し、レーザーをオンにします。

レーザーを30分間温めます。ビーム経路に障害物がないことを確認し、光パワーメーターを光経路のフォトニック結晶ファイバーの直前に配置します。コントロールボタンを押してシャッター1を開き、入力電力を測定します。

もう一度シャッター1を閉じます。パワーメーターを放物面鏡の後のフォトニック結晶ファイバーの出力に移動します。シャッター1を開き、入力3軸ステージを使用して出力電力を最大化します。

フォトニック結晶ファイバーを10分間ウォームアップさせ、3軸ステージを使用して出力電力を再び最大化し、PCFの伝送を記録します。中性密度フィルターの後にパワーメーターを移動し、フィルターを回転させてサンプルに到達するレーザー出力を調整します。測定された電力に残りの光学系の透過率を掛けて、サンプル電力を決定します。

次に、検流計とステージの電源を入れます。取得ソフトウェアを起動し、目的のイメージングパラメータを入力します。対物レンズに以前に適用したのと同じ浸漬媒体を使用して、サンプルをステージ上に置きます。

次に、部屋の照明を消し、カーテンを閉めて周囲の光が入らないようにします。次に、検出器の電源とアンプのスイッチを入れます。顕微鏡ステージを囲むライトボックスを閉じます。

電子制御スイッチを使用して、検出器シャッター3〜6を手動で開きます。取得ソフトウェアで、[クリックして取得を開始する]オプションを押して、SLAMイメージングを開始します。サンプルがはっきりと見えるまで、ステージコントローラーノブを使用して顕微鏡の焦点を調整します。

顕微鏡ステージコントローラーのジョイスティックを使用して、目的の視野を見つけます。配置したら、[停止してリセット]をクリックします。[保存] タブで、[データの保存] を [はい] に切り替えます。

次に、[クリックして取得を開始する]オプションを押して、イメージングが完了するまで待ちます。イメージング中にサンプルを操作するには、検出器のシャッターを閉じ、懐中電灯またはヘッドランプを使用して照明します。調整後、イメージング設定に戻ります。

画像取得を終了するには、検出器のシャッターを閉じ、検出器をオフにしてから、部屋の照明をオンにします。シャッター1を使用してレーザーをブロックし、レーザーをオフにします。検流計とステージの電源を切り、集録ソフトウェアを閉じます。

組織サンプルを適切に廃棄し、ワークステーションを清掃してください。適切に切断されたフォトニック結晶繊維は、その軸に垂直な平らな端面ときれいな面を示しました。切断が不十分なフォトニック結晶繊維は、斜めの切り込み、欠けた面、表面に顕著な傷や破片を示しました。

不適切な取り扱いや汚染により、繊維表面の周囲に目に見える汚れや粒子が蓄積し、空気穴のパターンが不明瞭になりました。黒ずんだ領域を持つ焼けたコアは、寿命の終わりに損傷したフォトニック結晶ファイバーを示しました。超連続体スペクトルは、約975-1、175ナノメートルに及び、上部が平らで、スペクトル変調が明確でした。

圧縮後のパルス自己相関は、狭い全幅半値を持つ対称的なプロファイルを示し、良好なパルス形成を示しています。適切に機能する超連続音源は、強い第2高調波信号と第3高調波信号を生成しました。超連続体が狭くなると、第2高調波信号は保持され、第3高調波信号強度が失われました。

パルス整形がないため、すべての非線形信号が大幅に減少し、かすかでコントラストの低い画像が得られました。ex vivo腎臓組織のSLAMイメージングに成功したところ、第3高調波発生やNADPH蛍光など、複数の強力な光信号を持つ明確なネフロン構造が示されました。腎間質性コラーゲン線維は、強い第二高調波発生信号を介して識別できました。

酸化還元比画像は、髄質と比較して腎皮質の近位尿細管における好気性ミトコンドリア代謝の上昇を示しました。2番目の酸化還元比マップは、酸化代謝と解糖代謝の空間的変動を確認し、組織内の異なるエネルギー使用を強化しました。