zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体の生成

このビデオでは、ゼブラフィッシュの改良された卵母細胞特異的状態ノックアウト法を紹介し、致死性または不妊性をもたらす接合変異を持つ母体因子を研究するための多用途のプラットフォームを提供します。現在の母体ノックアウト法は、技術的に困難であるか、時間がかかります。zpc:cas9導入遺伝子は、何世代にもわたって転写的にサイレンシングされることを以前に報告していました。

zpc:cas9ノックインラインを使用して、卵形成中に条件付きノックアウトを生成するための堅牢なプラットフォームを確立し、母体変異体の迅速かつ高効率な生産を可能にしました。まず、ホモ接合性 rbm24a RFPKI zpc:cas9 魚によって産卵された胚を収集します。1マイクロリットルのPGGダストEB rbm24a 4sGRNAと1マイクロリットルのTol2トランスポザーゼメッセンジャーRNAを組み合わせて、注射混合物を調製します。

プラスミドとTol2メッセンジャーRNAの両方を純水で直接希釈します。次に、ガラスカバーガラスを90mmの皿に入れます。カバーガラスの端に沿って胚を揃え、ピペットを使用して余分な水分をそっと取り除きます。

次に、調製した混合物2ナノリットルを各1細胞期胚の胚盤に注入します。注入された胚を青い水で優しくすすぎ、別の皿に移します。培養のために摂氏28度に設定されたインキュベーターに皿を入れます。

受精後24時間で、堅牢でユビキタスな青色蛍光タンパク質発現を示す胚を選択します。受精後4日で、強いトランスジェニック蛍光シグナルを維持する胚のみを育てます。モザイクトランスジェニックファウンダーメスと野生型オスとの交配から生成された胚を収集します。

蛍光実体顕微鏡を使用して、1細胞段階の青色蛍光タンパク質陽性胚をピックアップします。次に、胚を摂氏4度の4%パラホルムアルデヒドで一晩中適切な段階で固定します。1.5%OGER溶液を調製するには、OGER粉末を計量して1/3強度のリンゲル緩衝液に混ぜ合わせ、完全に溶解するまで沸騰させます。

溶かしたOGER溶液を90mmのペトリ皿に注ぎ、溶融アガロースにZモールドを挿入します。アガロースが固まったら、型をそっと取り外してすぐに使用できるプレートを作成します。次に、ニードルプーラーの設定を調整して2つの軽量ウェイトを使用し、ステップ1の手順を選択します。

ガラスキャピラリーをプーラーにロードして、メルトシール針を作ります。先のとがったピンセットを使用して、毛細管の先端を直径30〜40マイクロメートルにトリミングします。次に、マイクロフォージを使用して先端にスパイクを形成し、胚の浸透を助け、組織の損傷を軽減します。

推定される女性の創設者を野生型ゼブラフィッシュと交配し、胚を収集します。1細胞段階では、蛍光実体顕微鏡を使用して青色蛍光タンパク質陽性の胚を分離します。受精後3時間で、胚をプロナーゼ中でインキュベートし、3分の1の強度のリンゲル緩衝液に10分間溶解し、穏やかなピペッティングでそれらを脱絨毛膜化します。

除去された胚を、ペニシリンストレプトマイシンを添加した1/3リンゲルバッファーで満たされた調製したアルガロースプレートに慎重に移します。割球が細胞吸引のために毛細血管の先端を向くように胚の向きを変えます。次に、マイクロインジェクターを使用して、毛細管吸引力に対抗するために平衡圧力を穏やかに下げることにより、各胚から20〜40個の細胞を吸引します。

平衡圧を上げて、吸引された細胞を1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブの端にある2マイクロリットルの脱イオン水に放出します。次に、200マイクロリットルのRNA抽出試薬をチューブに加えて吸引された細胞を洗い流し、チューブを氷の上に置いて一時的に保管します。異常な表現型が視覚化されるまで、細胞吸引後の胚をアガロースプレートに保持します。

次に、抽出試薬中の選択された胚の細胞に40マイクロリットルのクロロホルムを加え、穏やかに混合します。次に、混合物を室温で1分間12, 000 Gで遠心分離します。上清を採取した後、1マイクロリットルのグリコーゲン溶液を加えます。

次に、上清の体積に基づいて等量のイソプロパノールを加え、完全に混合します。チューブを摂氏マイナス20度で30分間インキュベートし、RNA沈殿させます。次に、サンプルを摂氏4度で10分間12, 000 Gで遠心分離し、上清を廃棄します。

次に、RNAペレットを2回洗浄するには、500マイクロリットルの70%エタノールを加え、摂氏4度で1分間12, 000 Gで遠心分離します。上清を捨てた後、チューブの蓋を開けてペレットを室温で5分間乾燥させます。7マイクロリットルの水を加えてRNAペレットを溶解します。

First Strand cDNA合成キットを使用して逆転写を行い、PCRとサンガーシーケンシングを実施して、母体の変異胚の変異を解析します。母体の rbm24a 変異体は rbm24a RFP の欠如によって同定されましたが、他の母体の変異体は特定の表現型または細胞吸引ベースの遺伝子型検査によって検出されました。BFP陽性胚の中で、RFPシグナルを欠く胚は母体のrbm24a変異体として同定されました。

NANOS3プローブを使用したin situハイブリダイゼーションにより、Mrbm24a胚は4細胞段階で生殖質mRNAを胚芽顆粒に動員できず、受精後24時間で原始生殖細胞が欠如していることが明らかになりました。すべての成体のMrbm24aオスは、野生型メスによって産卵された卵子を受精させることに失敗し、正常な精巣に脂肪沈着物が置き換わる解剖学的異常を示しました。組織学的分析により、Mrbm24a 精巣に生殖細胞と精子が完全に存在しないことが確認されました。

ウェスタンブロット分析により、BFP陽性RFP陰性胚でRBM24aタンパク質のレベルがほぼ検出できないことが確認されました。RT-qPCRの結果は、対照と比較して、RFP陰性のBFP陽性胚のrbm24a転写産物レベルが有意に低いことを示しました。RT-PCRとサンガーシーケンシングにより、RFP陰性のBFP陽性とRFP陽性のBFP陽性胚の両方で大きな欠失とインデルが明らかになり、野生型転写産物はRFP陽性胚でのみ検出可能でした。

母体のGFPマーカーとnanog sgRNAを導入して母体のnanog変異体を生成し、GFP陽性胚はさまざまな背側表現型を示しました。生殖細胞系の伝播率は、GFP陽性のトランスジェニック系統の間で12%から32%の範囲でした。母体のナノグ変異体と一致する背側表現型は、GFP陽性胚の22%から60%で観察されました。