Name: zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体生成法。Tol2媒介sgRNA導入により卵形成期の条件付きノックアウトを実現し、致死性または不妊性を伴う接合子突然変異に関連する母性因子の研究を効率的に支援します。

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<ol><li>Fuentes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+coordinate+system%3A+Molecular-genetics+of+embryonic+axis+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish.</a> Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Huluwa+dictates+the+embryonic+body+axis+through+%CE%B2-catenin+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates.</a> Science. 362 (6417), eaat1045(2018).</li>
<li>Abrams, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+maternally-controlled+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions.</a> PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24+controls+poly%28A%29+tail+length+and+translation+efficiency+of+crystallin+mRNAs+in+the+lens+via+cytoplasmic+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).</li>
<li>Weidinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Xing, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+dishevelled+genes+in+zebrafish+reveals+distinct+functions+in+embryonic+patterning+and+gastrulation+cell+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements.</a> PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).</li>
<li>Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+program+of+oocytes+can+be+modified+in+vivo+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary.</a> J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+maternal+mutants+via+oocyte-specific+knockout+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system.</a> Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+maternal+mutants+via+oocyte+transgenic+expression+of+CRISPR-Cas9+and+sgRNAs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish.</a> Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+targeting-mediated+and+endogenous+gene+integrity-maintaining+knockin+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24a+dictates+mRNA+recruitment+for+germ+granule+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish.</a> EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T5+exonuclease-dependent+assembly+offers+a+low-cost+method+for+efficient+cloning+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+conditional+mutagenesis+using+transgenic+expression+of+Cas9+and+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs.</a> Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).</li>
<li>Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+zebrafish+cells+by+conventional+pneumatic+microinjector%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector.</a> Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Aharon, D., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Sexual determination in zebrafish.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+early+embryonic+primordial+germ+cells+promotes+zebrafish+female+differentiation+as+revealed+by+lifetime+labeling+of+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline.</a> Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+formation+of+primordial+germ+cells+from+zebrafish+blastomeres+by+germplasm+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors.</a> Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Bertho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dazl+regulates+cystogenesis+and+germline+stem+cell+specification+during+the+primordial+germ+cell+to+germline+stem+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition.</a> Development. 148 (7), dev.187773(2021).</li>
<li>Houwing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Piwi+and+piRNAs+in+germ+cell+maintenance+and+transposon+silencing+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish.</a> Cell. 129 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetally+localised+Vrtn+functions+as+a+novel+repressor+to+modulate+bmp2b+transcription+during+dorsoventral+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish.</a> Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x M5 HiPer Taq PCRミックス</td><td>メイ5バイオ</td><td>カタログ#MF001-BD-100</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>MDバイオ</td><td>カタログ#A006L</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep プラスミドミニプレップキット</td><td>アクシーゲン</td><td>カタログ#AP-MN-P-4</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリー電気泳動装置(Qsep400)</td><td>バイオオプティック</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>DIGラベリングミックス</td><td>ロシュ</td><td>カタログ#11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ロシュ</td><td>カテゴリ#4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DTTの</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カタログ#R0861</td><td></td></tr><tr><td>ファーストストランドcDNA合成キット</td><td>トランスジェンバイオテック</td><td>カタログ#AT301</td><td></td></tr><tr><td>GenCrispr NLS-Cas9-NLSヌクレアーゼ</td><td>ジェンスクリプト</td><td>カタログ#Z03389</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー(1.0 x 100 mm)</td><td>ランタイ教育機器工場</td><td>カタログ#OS-2B</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>BBIライフサイエンス</td><td>カタログ #28985</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズム 9</td><td>グラフパッド</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>イメージJ</td><td>オープンソース</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>バイオ テクノロジー</td><td>カタログ#CA1351</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフォージ(MF2)</td><td>成重</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ分光光度計(Nano-300)</td><td>オールシェン</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>オリビア</td><td>オリンポス</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>カタログ#15140122</td><td></td></tr><tr><td>ピコリットルインジェクター(PLI-100A)&nbsp;</td><td>ハーバード大学装置</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>先のとがったピンセット</td><td>WPIの</td><td>カタログ#500341</td><td></td></tr><tr><td>先のとがったピンセット</td><td>&nbsp;WPI&nbsp;</td><td>500341</td><td></td></tr><tr><td>プーラー(PC-100)</td><td>成重</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>リボロックRNase阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カタログ#EO0381</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カタログ#R0481</td><td></td></tr><tr><td>シリコンヒドロキシル磁気ビーズ</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>カタログ#B518720-0001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>カタログ#M0251L</td><td></td></tr><tr><td>ゾルド</td><td>WPIの</td><td>Cat# Z モールド</td><td></td></tr></tbody></table>

zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体の生成

Generation of Maternal Mutants Using zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

rbm24a母系変異体の急速生成 母体のBFPマーカーと、rbm24aコード配列を標的とする4つの高効率sgRNAの発現を可能にするトランスジェニックベクターを構築しました。このベクターをTol2転位を介してホモ接合型rbm24a-RFP KIzpc:cas9胚に導入した後、Rbm24a-RFPタンパク質が存在しないため、BFP陽性F1胚間でMrbm24aが容易かつ迅速に同定されました(Figure 11A-D)。BFP陽性胚の約30%〜70%はRFPシグナルを欠いていました。これらのMrbm24a胚は、nanos3プローブを用いたin situハイブリダイゼーションで示されるように、胚芽顆粒への生殖形質mRNAの...

Oogenesis and early embryonic development are critically dependent on maternally derived mRNAs and proteins. Eliminating these maternal factors ...

generation-of-maternal-mutants-using-zpccas9-knock-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

胞胚や原腸胚の段階で移植の対象となるキメラゼブラフィッシュの胚を生成するためのステップバイステップのガイド。...

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

このビデオでは、ゼブラフィッシュの卵黄嚢に化合物を送達するための胚マイクロインジェクションの技術について説明しています。...

胚マイクロインジェクション:ゼブラフィッシュの卵黄に化合物を送達する技術

ゼブラフィッシュは、高等脊椎動物との遺伝的類似性から、発生生物学およびヒト疾患研究のための強力なモデルシステムです。このプロトコルは、初期胚形成に不可欠な遺伝子の劣性突然変異を特定するためのフォワードスクリーニング戦略に利用できる一倍体ゼブラフィッシュ胚を作成する方法論を説明しています。...

半数ゼブラフィッシュ胚の生成により<em&gt;体外</em&gt;受精

母方の遺伝子産物の操作に使用ゼブラフィッシュの卵母細胞の体外成熟のために最適化されたプロトコルは、ここに示されています。...

母親の遺伝子産物の機能操作の使用<em&gt;インビトロ</emゼブラフィッシュにおける&gt;卵成熟

このプロトコルの目的は、選択的な育成によってゼブラフィッシュにおける致命的な骨格変異表現型の浸透度を変更することです。致命的な突然変異体が大人に成長することはできません彼ら自身を繁殖、このプロトコルが追跡とテストの子孫によって複数の生成を通して浸透度を選択するための方法を記述するため。...

テストの子孫によるゼブラフィッシュ致死の骨格変異の浸透度をシフト

対象となるゲノム編集モデルにおける動脈分布(ゼブラフィッシュ) は、CRISPR ベースのアプローチの出現によって大きく促進されています。ここで、生成・ ヘテロ二本鎖移動性試金が組み込まれたナンセンスの CRISPR 由来の対立遺伝子の同定と次世代シーケンシングによる突然変異の同定の合理化された、堅牢なプロトコルについて述べる.

効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト

初期の開発は母性遺伝製品に依存しており、これらの製品の多くの役割は現在不明です。ここでは、CRISPR-Cas9を使用して、単一世代で母性効果表現型を特定するプロトコルについて説明しました。...

母体クリスパントによる初期発生における母体発現遺伝子の役割の決定

このプロトコルは、CRISPR-Cas9技術を使用してゼブラフィッシュ胚の正確なノックイン編集を容易にするアプローチを説明しています。表現型パイプラインは、QT延長症候群関連遺伝子変異をモデル化するためのこれらの技術の適用可能性を実証するために提示される。...

CRISPR-Cas9を介したゼブラフィッシュハートの正確なノックイン編集

この研究では、トランスジェニックコンストラクトを作成してゼブラフィッシュ胚に注入するためのゲートウェイベースのクローニング方法であるモジュラーTol2トランスジェネシスシステムのプロトコルについて説明します。...

ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ

CRISPR-Cas技術は、ゲノム編集の分野に革命をもたらしました。ただし、目的の生殖細胞系列編集を見つけて分離することは、依然として大きなボトルネックです。したがって、このプロトコルは、標準的なPCR、制限消化、およびゲル電気泳動技術を使用して、F0...

ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング

学ぶ zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体生成法。Tol2媒介sgRNA導入により卵形成期の条件付きノックアウトを実現し、致死性または不妊性を伴う接合子突然変異に関連する母性因子の研究を効率的に支援します。

zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体の生成

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