タンパク質と糖鎖の相互作用の探索:核磁気共鳴の進歩

タンパク質間およびタンパク質間およびタンパク質と糖鎖の相互作用を、インテグリン-ジスインテグリン複合体に焦点を当てて研究します。私たちのモデルは構造力学を調査し、複雑な形成と相互作用の安定性を媒介する表面力の役割を強調しています。私たちのグループは、タンパク質に存在する表面疎水性クラスターを研究することにより、分子認識と結合部位の進化における表面力の役割の研究に専念しています。

NMRソリューションにより、タンパク質相互作用の検出が可能になります。弱い相互作用は生命にとって不可欠ですが、多くの重要な生物学的機能に存在するにもかかわらず、高親和性複合体に偏っています。私たちのグループは、統合構造生物学のアプローチを使用して、大きなタンパク質複合体を研究することに焦点を当てています。

私たちは、NMRを主要なツールとして使用して、ダイナミクスと機能的側面を研究しています。まず、50ミリモルの塩化ナトリウムと5%酸化重水素を含む、pH 7.4のリン酸ナトリウム緩衝液中のD-マンノースの4ミリモル溶液を調製します。溶液を2つのサンプルに分け、1つは80マイクロモルのCVNを含み、もう1つは含まない。

NMR分光計で化学シフト摂動によるリガンド結合をマッピングするには、H1C13 HSQC取得用のHSQCTOPSIパルスシーケンスを設定します。時間領域、スペクトル幅、キャリア周波数、およびスキャン数を設定します。提供された式を使用して化学シフト摂動を計算します。

飽和移動差によってリガンド結合をマッピングするには、まず新しいデータセットを作成します。STD NMR実験のパラメータは、異なる飽和周波数をスクリーニングするか、飽和時間を変化させながら周波数を固定してビルドアップを評価することにより構成します。ZGPRパルスシーケンスを使用して1D H1 NMR実験を設定します。

分光計をH1に調整し、シミングを実行し、90度のハードパルスを測定します。搬送波周波数を水信号に対応する約4.7ppmに中央に配置し、STDDIFFESGPを選択します。3パルスシーケンスを作成し、取得パラメータを設定します。

必要に応じてスペクトル幅を設定し、実験の目標に従って、インタースキャン遅延D1を4秒にし、飽和時間D20を定義します。FQ2リストに、オフ共鳴周波数をマイナス40ppmでロードし、オン共鳴周波数でタンパク質のみを飽和させます。マイナス 0.59、0.73、および 8.1 ppm のオン共振周波数をテストして、最適な条件を決定します。

最適な周波数を使用して、0.5、1、1.5、2、2.5、3、および4秒の飽和時間でSTDスペクトルを取得します。対応するASTD値を飽和時間の関数としてプロットします。次に、スキャン数を 64 に設定し、実験ループを 4 回平均化します。

次に、スキャンの総数を計算します。インタースキャン遅延を4秒に、取得時間を2.7262976秒に設定します。持続時間を50ミリ秒に設定し、整形プログラム9SP9を介してガウス形状を制御して、飽和パルスを設定します。

STD NMRバリアントにT1行フィルターを適用し、タンパク質サイズに基づいてスピンロック時間D29を設定します。リガンド結合H1 R2をマッピングするには、まず、ブルカー標準ライブラリからCPMG_ESGP2Dパルスプログラムを選択します。実験を2D取得として設定します。

図のように取得パラメータを設定します。次に、それぞれ8回のスキャンを200サイクル実行します。CPMGサイクルの希望する合計時間に応じて、可変カウンタリストを調整します。

タンパク質を含むサンプルとリガンドのみのサンプルの2つの実験を実行します。コマンドEFPまたはsine Mの後にFPを使用して、各TCPMGのH1スペクトルをプロットし、最適な処理戦略に従ってウィンドウ関数を調整します。式を使用してCPMG商Qを計算します。

N15標識CVNのスペクトルH1N15HSQC 298ケルビンで取得します。D-マンノースで滴定して、最終濃度のゼロ、1、2、5、10、20、40、および60ミリモルに達します。ブルカー標準ライブラリの位相感応FHSQCF3GPPH高速HSQCパルスシーケンスを使用します。

次に、式を使用して化学シフト摂動を計算します。式5を使用して解離定数KDを決定するために、D-マンノース濃度の関数として各残基のCSP値をプロットします。次に、数式を使用して、結果のデータを単一の結合等温線に当てはめます。

位相に敏感なHSQCT2ETF3GPSI3Dパルスシーケンスを使用し、298ケルビンで60ミリモルのD-マンノースの存在下でCVN残基の個々の残基のN15 R2値を測定するために、図のようにパラメータを設定します。NMRPipeを使用して擬似3次元スペクトルを処理し、緩和遅延ごとにHSQCのようなスペクトルを生成します。処理されたスペクトルを解析プラットフォームにインポートします。

次に、すべてのスペクトルを選択し、強度変化の追跡ツールを適用します。各クロスピークの強度をT弛緩の関数としてプロットし、崩壊を単指数関数に当てはめて、各残基のN15 R2値を抽出します。HSQCライクスペクトルの信号対雑音比から67.84ミリ秒の実験誤差を計算します。

ノイズのみを含むスペクトルの領域を処理し、指定されたコマンドを使用してテキストファイルに変換します。次に、統計ソフトウェアを使用してノイズ領域またはノイズ強度の標準偏差を決定します。与えられた式を使用して実験誤差を計算します。

CVNの存在下でD-マンノースの両方のアノマー型で化学シフト摂動が観察され、ベータ-D-マンノースではより大きなシフトが見られ、優先的な結合を示しています。CVNの存在下でほとんどのD-マンノース水素について、遊離状態と結合状態に対応する2つの異なるピークが観察されました。最も高いASTD値を示す水素原子核は、CVNとの強い双極相互作用と一致して、ベータ-D-マンノースと関連していました。

横方向の緩和速度分析では、Hベータ4は、CVNに結合した際に緩和の顕著な増加を示した唯一の陽子でした。リガンドの添加によって誘発されるH1およびN15の化学シフト摂動は、10ミリモルまでの濃度で最高でした。ベータ鎖内の残基I40、E41、N42、V43、D44、およびG45は、有意な化学シフト摂動を示し、D-マンノースの高親和性結合部位として特定されました。

結合等温線は、残基D44がベータ鎖残基の中で最も高い親和性を持ち、解離定数が約1ミリモルであることを示しました。N15 R2緩和率の測定は、D-マンノース結合時のデルタR2値の増加と減少の両方を示し、コンフォメーション安定化と交換プロセスの組み合わせを示唆しました。残基 C58、R59、K74、および R76 はデルタ R2 値の増加を示し、高親和性結合部位への関与を確認し、残基 F4、C8、R24、および G27 は低親和性領域を表しました。