Name: タンパク質と糖鎖の相互作用の探索:核磁気共鳴の進歩 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶタンパク質と糖鎖の相互作用のNMR解析手法。インテグリン・ディスインテグリン複合体の構造動態と表面力の役割を解明し、弱い相互作用の検出と糖鎖特異的診断への応用を示します。

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<table><tbody><tr><td>13Cグルコース</td><td>Cambrige同位体ラボ</td><td>CLM-481</td><td></td></tr><tr><td>15N塩化アンモニウム</td><td>Cambrige同位体ラボ</td><td>NLM-467</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>コケテルはプロテアーゼを阻害します</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Cambrige同位体ラボ</td><td>DLM-4</td><td></td></tr><tr><td>D-マンノース</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M2069-5G</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NMRパイプ</td><td></td><td></td><td>ソフトウェアチュートリアルへのリンク: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html</td></tr><tr><td>塩化カリウム(K2HPO4)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KH2PO4)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>重見管</td><td>ブルカー</td><td>Z1Z10684A</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム(Na2HPO4)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム(NaH2PO4)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S97263</td><td></td></tr><tr><td>分光器 Bruker 600 MHz</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光器 Bruker 800 MHz</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チアミン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>トリプル共振TXIプローブ</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>93657</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質と糖鎖の相互作用の探索:核磁気共鳴の進歩

Exploring Protein-Glycan Interactions: Advances in Nuclear Magnetic Resonance

本研究では、タンパク質と糖鎖の相互作用を調べるためのNMR実験を発表しました。タンパク質-糖鎖分子認識は、細胞接着、遊走、増殖、その他のさまざまな形態の細胞コミュニケーションの調節を含む、細胞外マトリックス (ECM) を含む多くの生物学的プロセスの根底にあります。
ここでは、弱い結合剤として説明されている単糖類D-マンノースを使用することを選択しました。目的は、過渡相互作用を測定する方法を説明し、結合メカニズムの解明におけるその重要性を強調することでした。リガンドの相互作用部位を特徴付けるために、3つの異なるリガンドベースのNMRアプローチが採用されました。
最初の方法は、CVNの存在下でD-マンノースの化学シフト摂動(CSP)を評価することでした。この目的のために、CVNと比較して50倍のD-マンノース(図1A)と遊離D-マンノースを含むサンプルの1つのH-13 C-HSQCスペクトルを、同一のバッファ条件下で記録しました(<strong c...

Protein-glycan interactions are central to many biological processes and are increasingly recognized as promising targets for diagnostic strategies in ...

タンパク質間およびタンパク質間およびタンパク質と糖鎖の相互作用を、インテグリン-ジスインテグリン複合体に焦点を当てて研究します。私たちのモデルは構造力学を調査し、複雑な形成と相互作用の安定性を媒介する表面力の役割を強調しています。私たちのグループは、タンパク質に存在する表面疎水性クラスターを研究することにより、分子認識と結合部位の進化における表面力の役割の研究に専念しています。NMRソリューションにより、タンパク質相互作用の検出が可能になります。弱い相互作用は生命にとって不可欠ですが、多くの重要な生物学的機能に存在するにもかかわらず、高親和性複合体に偏っています。私たちのグループは、統合構造生物学のアプローチを使用して、大きなタンパク質複合体を研究することに焦点を当てています。私たちは、NMRを主要なツールとして使用して、ダイナミクスと機能的側面を研究しています。まず、50ミリモルの塩化ナトリウムと5%酸化重水素を含む、pH 7.4のリン酸ナトリウム緩衝液中のD-マンノースの4ミリモル溶液を調製します。溶液を2つのサンプルに分け、1つは80マイクロモルのCVNを含み、もう1つは含まない。NMR分光計で化学シフト摂動によるリガンド結合をマッピングするには、H1C13 HSQC取得用のHSQCTOPSIパルスシーケンスを設定します。時間領域、スペクトル幅、キャリア周波数、およびスキャン数を設定します。提供された式を使用して化学シフト摂動を計算します。飽和移動差によってリガンド結合をマッピングするには、まず新しいデータセットを作成します。STD NMR実験のパラメータは、異なる飽和周波数をスクリーニングするか、飽和時間を変化させながら周波数を固定してビルドアップを評価することにより構成します。ZGPRパルスシーケンスを使用して1D H1 NMR実験を設定します。分光計をH1に調整し、シミングを実行し、90度のハードパルスを測定します。搬送波周波数を水信号に対応する約4.7ppmに中央に配置し、STDDIFFESGPを選択します。3パルスシーケンスを作成し、取得パラメータを設定します。必要に応じてスペクトル幅を設定し、実験の目標に従って、インタースキャン遅延D1を4秒にし、飽和時間D20を定義します。FQ2リストに、オフ共鳴周波数をマイナス40ppmでロードし、オン共鳴周波数でタンパク質のみを飽和させます。マイナス 0.59、0.73、および 8.1 ppm のオン共振周波数をテストして、最適な条件を決定します。最適な周波数を使用して、0.5、1、1.5、2、2.5、3、および4秒の飽和時間でSTDスペクトルを取得します。対応するASTD値を飽和時間の関数としてプロットします。次に、スキャン数を 64 に設定し、実験ループを 4 回平均化します。次に、スキャンの総数を計算します。インタースキャン遅延を4秒に、取得時間を2.7262976秒に設定します。持続時間を50ミリ秒に設定し、整形プログラム9SP9を介してガウス形状を制御して、飽和パルスを設定します。STD NMRバリアントにT1行フィルターを適用し、タンパク質サイズに基づいてスピンロック時間D29を設定します。リガンド結合H1 R2をマッピングするには、まず、ブルカー標準ライブラリからCPMG_ESGP2Dパルスプログラムを選択します。実験を2D取得として設定します。図のように取得パラメータを設定します。次に、それぞれ8回のスキャンを200サイクル実行します。CPMGサイクルの希望する合計時間に応じて、可変カウンタリストを調整します。タンパク質を含むサンプルとリガンドのみのサンプルの2つの実験を実行します。コマンドEFPまたはsine Mの後にFPを使用して、各TCPMGのH1スペクトルをプロットし、最適な処理戦略に従ってウィンドウ関数を調整します。式を使用してCPMG商Qを計算します。N15標識CVNのスペクトルH1N15HSQC 298ケルビンで取得します。D-マンノースで滴定して、最終濃度のゼロ、1、2、5、10、20、40、および60ミリモルに達します。ブルカー標準ライブラリの位相感応FHSQCF3GPPH高速HSQCパルスシーケンスを使用します。次に、式を使用して化学シフト摂動を計算します。式5を使用して解離定数KDを決定するために、D-マンノース濃度の関数として各残基のCSP値をプロットします。次に、数式を使用して、結果のデータを単一の結合等温線に当てはめます。位相に敏感なHSQCT2ETF3GPSI3Dパルスシーケンスを使用し、298ケルビンで60ミリモルのD-マンノースの存在下でCVN残基の個々の残基のN15 R2値を測定するために、図のようにパラメータを設定します。NMRPipeを使用して擬似3次元スペクトルを処理し、緩和遅延ごとにHSQCのようなスペクトルを生成します。処理されたスペクトルを解析プラットフォームにインポートします。次に、すべてのスペクトルを選択し、強度変化の追跡ツールを適用します。各クロスピークの強度をT弛緩の関数としてプロットし、崩壊を単指数関数に当てはめて、各残基のN15 R2値を抽出します。HSQCライクスペクトルの信号対雑音比から67.84ミリ秒の実験誤差を計算します。ノイズのみを含むスペクトルの領域を処理し、指定されたコマンドを使用してテキストファイルに変換します。次に、統計ソフトウェアを使用してノイズ領域またはノイズ強度の標準偏差を決定します。与えられた式を使用して実験誤差を計算します。CVNの存在下でD-マンノースの両方のアノマー型で化学シフト摂動が観察され、ベータ-D-マンノースではより大きなシフトが見られ、優先的な結合を示しています。CVNの存在下でほとんどのD-マンノース水素について、遊離状態と結合状態に対応する2つの異なるピークが観察されました。最も高いASTD値を示す水素原子核は、CVNとの強い双極相互作用と一致して、ベータ-D-マンノースと関連していました。横方向の緩和速度分析では、Hベータ4は、CVNに結合した際に緩和の顕著な増加を示した唯一の陽子でした。リガンドの添加によって誘発されるH1およびN15の化学シフト摂動は、10ミリモルまでの濃度で最高でした。ベータ鎖内の残基I40、E41、N42、V43、D44、およびG45は、有意な化学シフト摂動を示し、D-マンノースの高親和性結合部位として特定されました。結合等温線は、残基D44がベータ鎖残基の中で最も高い親和性を持ち、解離定数が約1ミリモルであることを示しました。N15 R2緩和率の測定は、D-マンノース結合時のデルタR2値の増加と減少の両方を示し、コンフォメーション安定化と交換プロセスの組み合わせを示唆しました。残基 C58、R59、K74、および R76 はデルタ R2 値の増加を示し、高親和性結合部位への関与を確認し、残基 F4、C8、R24、および G27 は低親和性領域を表しました。

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JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、15のN標識野生型および変異型エンボプラキンタンパク質と非標識ビメンチンタンパク質との間のタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴分光法の技術について説明しています。野生型エンボプラキンとビメンチンとの相互作用が成功すると、NMRスペクトルでは広範な線幅が広がり、ピークが消失しますが、変異したエンボプラキンとビメンチンとの間に相互作用がないと、NMRスペクトルではピークが十分に分解されます。...

原子レベルのタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

ここで、安定同位体と核磁気共鳴 (NMR) 分光法とマイクロ スケールを用いたタンパク質間相互作用の後の評価と生産のラベルが付いている蛋白質の浄化のためのプロトコルを紹介します。働く (MST)...

核磁気共鳴分光法 (NMR) とマイクロ働く (MST) による球状と糸状のタンパク質の相互作用を測定

このプロトコルは、オンラインリソースでヒトタンパク質グリカムを探索、比較、および解釈する方法を示しています。...

グリカン媒介タンパク質相互作用の研究のためのバイオインフォマティクスリソース

ここでは、溶液中のタンパク質-糖鎖相互作用の特性評価を目的とした一連のNMR実験の取得、処理、および分析を詳述したプロトコールを紹介します。最も一般的なリガンドベースおよびタンパク質ベースの方法論が概説されており、構造糖鎖生物学および分子認識研究の分野に貢献していることは間違いありません。...

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

&gt;jove_content&lt;ここでは、タウタンパク質をケーススタディとして、核磁気共鳴分光法(NMR)によって天然変性タンパク質の複数のリン酸化を特定する方法について説明します。組換えタウは、データ取得および解析の前に、キナーゼによって同位体的に濃縮および修飾されます。...

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

多次元固体 NMR 分光法と動的核スピン偏極 (DNP) 調査の13C、15N...

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

RNAポリメラーゼとの転写因子(TF)の相互作用は、通常、プルダウンアッセイを用いて研究される。我々は、クラミジアRNAポリメラーゼとのGrgAの相互作用を特徴付けるためにバイオレイヤー干渉計(BLI)技術を適用する。プルダウンアッセイと比較して、BLIはリアルタイムの関連付けと解離を検出し、より高い感度を提供し、高い定量性を提供します。...

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

ここで提供されるプロトコルは、異なる組織および脳の様々な領域から分離されたミトコンドリアを有する異なるペプチドおよびタンパク質のネイティブ形態、プレフィブリル、および成熟したアミロイド線維の相互作用を調るためのプロトコルである。...

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

学ぶタンパク質と糖鎖の相互作用のNMR解析手法。インテグリン・ディスインテグリン複合体の構造動態と表面力の役割を解明し、弱い相互作用の検出と糖鎖特異的診断への応用を示します。

タンパク質と糖鎖の相互作用の探索:核磁気共鳴の進歩

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