ノックアウトマウス生成のための卵管核酸送達に基づくin vivoエレクトロポレーション技術によるゲノム編集の改善

私たちの研究範囲は、妊娠中の女性の卵管に直接ゲノム編集成分を送達することで、子宮内電気穿孔を用いてノックアウトマウスの生成を簡素化することです。受精卵への微量注射は、ドナーと受給者のメス、そして精管切除されたオスを含む多数の動物を維持する必要があります。したがって、動物利用を最小限に抑えるプロトコルが望ましいです。

受精卵電気穿孔にNepa21システムを用いることで、標準的な核注入技術と同等の効率で標的遺伝子ノックアウトマウスを一段階で生成できるユニークな機会を提供します。まず、計算解析ツールを用いて、対象遺伝子を標的とする単一ガイドRNA配列を特定することから始めましょう。目的の変異部位にできるだけ近いエクソン内の配列を選択します。ゲノムブラウザを使ってエクソーム構造を照合し、ほとんどのスプライスアイソフォームに含まれる配列を優先してください。

ツールの統合スコアリングシステムを使って、各ガイドシーケンスの予測オフターゲット活性を分析します。ターゲット外結合の可能性が最も低い配列を選びましょう。線形二本鎖DNAテンプレートを作成するには、表で指定された成分を用いてPCRマスターミックスを準備します。

ポリメラーゼは最後に加え、マスターミックスは酵素の安定性を保つために氷で保管します。その後、以下の熱サイクル条件でPCRを実行します。次に、与えられた成分を用いてin vitro転写マスターミックスを準備し、温度を一定に制御するためにサーモサイクラーを使って37度で1.5時間インキュベーションします。

次に、反応に2マイクロリットルのDNase Iを加えます。DNAテンプレートを37度でさらに30分間培養し、その後75度で5分間不活性化します。TRIzolによるRNA精製後、分光光度計でRNA濃度を測定し、A260対A280およびA260対A230の比率を確認します。

リボ核タンパク質複合体をトランスフェクションのために準備するには、ヌクレアーゼフリー水を使って1モルのトリスHClバッファーを希釈して100ミリモラー濃度にします。0.022マイクロメートルの細孔径のシリンジフィルターで溶液をろ過します。10マイクロリットルの分量に分割し、使用まで4度の温度で保存します。

次に、spCas9ヌクレアーゼ、シングルガイドRNA、トリスHClをDEPC水で希釈してヌクレアーゼフリーチューブでトランスフェクションミックスを準備します。トランスフェクションミックスを37度Cで10分間培養し、リボ核タンパク質複合体の形成を促します。次に、トランスフェクション混合物を単一のI-GONADセッションに適した小容量に分割し、試薬活性を保持するために4度の温度に保ちます。

CD1のメスマウスと単一飼育のCD1オスマウスを一晩交配させた後、各メスに交尾プラグの有無を確認します。目に見えるプラグのあるメスだけを新しいケージに移し、さらなる実験処置を行います。使用前に無菌性を確保するために、すべてのステンレス製手術器具をオートクレーブ処理してください。

その後、選択されたプラグ=陽性のメスマウスを電子体重計で測定してから麻酔します。麻酔を受けたマウスの足のつまみ反射の喪失を監視し、十分な麻酔が行われているか確認してください。施術中は体温を保つために、マウスを温熱パッドの上に置いてください。

次に、乾燥を防ぐために獣医用の軟膏を目に塗布します。細かいハサミを使って、腰の下部の皮膚に0.7センチメートルの縦方向の切開をします。次に、はさみのわずかに開いた先端を横方向に広げ、皮膚切開部を約1.3センチまで優しく広げます。

その後、腹膜に0.7センチの切開を慎重に開けて腹腔を露出させます。腹膜切開を1.1センチまで伸ばし、わずかに開いたハサミ先端で両側に押します。卵巣につながっている脂肪パッドを見つけ、鉗子を使って卵巣、卵管、子宮が露出するまで優しく外側に引っ張ってください。

血管クランプを使って脂肪パッドを固定し、生殖器官を安定させます。次に、リボヌクレオプロテイン注入ミックスをストリッパーピペッターを使って使い捨てのプラスチック毛細管に2マイクロリットル注入します。マイクロハサミを使って、アンプラの数ミリ上流の卵管壁に0.2センチの切開を入れます。

ストリッパーピペッターに取り付けられたプラスチック毛細血管を卵管切開部に挿入し、空気を導入せずに注入混合物を慎重に排出します。輸卵管からプラスチック毛細血管を優しく引き抜き、注射を完了させます。前面パネルの電源スイッチを押して電気分孔器を起動します。

画面に表示されたように装置の電気孔離パラメータを設定します。ピンセット型電極を使い、卵管を優しく掴み、キロオームボタンを押して抵抗を測定します。抵抗測定後すぐにスタートボタンを押して電気穿孔を開始し、オームボタンで終了信号が出るのを待ちます。

最初の卵管の電気穿孔後、生殖管を優しく腹腔に戻します。4-0ポリグリコール酸外科用縫合糸で切開部を閉じます。ジェノタイピングには、融点約60度の18〜21塩基長プライマーを設計し、300〜600塩基対のPCR産物を生成します。

各プライマーの特異性を確認するために、非特異的増幅のリスクを排除するために、マウスゲノムデータベースに対してBLAST検索を行います。次に、耳パンチを使ってマウスの耳から約2ミリメートルの小さな組織サンプルを採取し、DNA抽出を行います。溶解バッファーを100マイクロリットル追加します。

サンプルを95度Cで60分間孵化し、効率的な溶解を確保するために20分ごとに渦巻きます。サンガーシーケンスを行った後、結果を解析してゲノム編集の結果を評価します。ICE解析を使用するには、両方のサンガーシーケンスファイルをアップロードし、ガイドRNA配列を入力し、CRISPR実験で使用される適切なヌクレアーゼを選択します。

次にTIDEを使用するには、対照および実験シーケンスファイルをAB1形式でアップロードし、ガイドRNA配列を入力します。ICE解析では、Cas9切断部位で3つの異なるインデル変異が検出されました。配列の42%で1塩基対欠失、25%で3塩基対欠失、27%で23塩基対欠失が認められました。モデル適合度は0.94、ノックアウトスコアは69で、強い相関予測と遺伝子ノックアウトの可能性を示しました。

シーケンスクロマトグラムでは、編集サンプルのCas9カット部位で破壊が確認され、対照クロマトグラムでは同じ部位で完全な配列が示されました。6匹の電気孔細胞マウスのうち、変異を持つ子を生み出したのは4匹だけで、編集効率は全体の60%に達しました。6匹の電気穿孔マウスの全ての子マウスの子は減少し、1匹あたり3〜4匹の子犬にとどまりました。