キメラ抗原受容体細胞外小胞 (CAR-EV) 技術の強化: がん治療の未来

エクソソームをベースとした診断・治療の開発を研究しています。目的は、側腫瘍の治療のために、細胞ベースの治療よりも安全で効果的でアクセスしやすいキメラ抗原受容体エクソソームベースの治療法を開発することです。当社のEXO-NETおよびEXO-ACEプラットフォームは、スケーラブルで再現性があり、GMPに準拠したエクソソームを高収率と高純度で単離し、研究および治療における従来の方法の限界に対処します。

EXO_NETネットとEXO-ACEは、研究、診断、治療用途において、優れた純度と再現性を備え、遠心分離と沈殿を上回り、迅速でスケーラブルなGMP準拠のEV分離を可能にします。当社は、CAR-EVを設計し、次世代の無細胞標的治療薬を提供するための、迅速でスケーラブルで検証済みの方法を開発しました。これにより、臨床的ニーズがある他の疾患に適用できる堅牢なワークフローが提供されます。

次の目標は、固形腫瘍やその他の炎症性疾患を治療するためのRNA治療薬を送達するためのCAR-EVを生成するために開発および検証された方法を使用することです。まず、イオン交換カラムを15分間直立させて室温に戻します。ピペットを使用して、10カラム容量の再生バッファーを追加し、続いて10カラム容量の平衡化バッファーを追加します。

THOD調整培地を0.22マイクロメートルのポリエーテルスルホンフィルターに通します。次に、ろ過したサンプルを平衡化カラムに最大 31.2 カラム容量加算します。次に、10 カラム容量の洗浄バッファーを加え、続いて 2.5 カラム容量の溶出バッファーを追加します。

濃縮された細胞外小胞を含む流れを収集します。30キロダルトン限外ろ過遠心フィルターと希釈剤を使用して、細胞外小胞溶出液に対してバッファー交換を行い、最低100倍の希釈を確保します。実験のニーズに基づいて、交換溶液の最終容量を調整します。

濃縮した細胞外小胞サンプルを0.22マイクロメートルのフィルターに通し、in vitroアッセイのために滅菌します。ナノ粒子追跡分析を使用して、CAR細胞外小胞のサイズ分布、濃度、および収量を決定します。ハイスループットのパンエクソソーム細胞外小胞を単離するには、電源を入れて装置にログインします。

HT EVタンパク質単離プロトコルを確立するための設定を構成します。チップコームを96ウェルディープウェルプレートに入れて、チップコームプレートを準備します。各ウェルに1ミリリットルのPBSを加えて、3つの洗浄プレートを準備します。

次に、35マイクロリットルの1%SDSバッファーを96ウェルプレートの各ウェルにピペッティングして溶出プレートを準備します。次に、1ミリリットルのコンディショニング培地を加えて結合プレートを調製します。自動分離システムで、プログラムHT EV Protein Isolation Protocolを選択してプロトコルを開始し、再生ボタンを選択します。

装置を開いて、プレートのロードを開始します。装置の指示に従い、準備した溶出プレートをロードし、続いて3洗浄ディープウェルプレートを装置にロードします。結合プレートをロードする直前に、30マイクロリットルのパンエクソソームキャプチャービーズを各ウェルに加えます。

バインディングプレートを装置にロードし、次にチップコームプレートをロードし、装置を閉じてバインディングを開始します。このシステムは、コンディショニングされた培地サンプルと磁気ビーズを低速で 30 分間連続的に混合し、細胞外小胞の効率的な捕捉を促進します。結合ステップが完了したら、システムに 3 つの洗浄ステップを実行し、低速で 30 秒間混合して非特異的汚染物質を除去します。

自動化システムが30秒間のボトムミックスを実行することにより、タンパク質回収のための細胞外小胞溶解を開始できるようにします。インキュベーション中、装置はピペットチップを各ウェルの上に配置したまま、7分30秒間一時停止します。さらに 30 = 秒のミックスを開始し、その後、さらに 7 分 30 秒の一時停止を行います。

プロトコルが終了すると、システムは使用済みのチップコームを持ち上げ、溶液を96ウェルプレートに残し、磁気ビーズをチップに取り付けます。最後に、器具はリーブステップに進み、チップコームをチップコームプレートに戻します。機器を開き、プレートを取り外します。

GFP蛍光により、形質導入されたT細胞におけるCAR発現が確認され、細胞クラスターでの局在が明らかであり、明視野チャネルとGFPチャネルを重ね合わせることによって共局在が検証されました。ナノ粒子追跡分析により、EGFRおよびHER2 CARコンストラクトの両方について、コンディショニング培地と比較して、濃縮EV画分中の細胞外小胞の濃度が有意に高いことが明らかになりました。ウェスタンブロッティングにより、CAR発現細胞および単離された細胞外小胞にグランザイムBが存在することが確認され、細胞外小胞にはカルネキシンが存在せず、細胞汚染の欠如が示されました。

EGFRを標的とするCAR細胞外小胞は、MCF-7乳がん細胞の生存率を70%、K-562血液がん細胞の生存率を40%有意に低下させましたHER2を標的とするCAR細胞外小胞は、MCF-7乳がん細胞の生存率を約10%低下させましたが、K-562血液がん細胞には観察可能な影響はありませんでした。