Name: キメラ抗原受容体細胞外小胞 (CAR-EV) 技術の強化: がん治療の未来 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶCAR細胞由来細胞外小胞の高効率分離法とがん細胞への標的治療応用。イオン交換クロマトグラフィーとナノ粒子追跡分析を用いて、固形腫瘍治療における細胞外小胞の治療効果を検証する革新的アプローチです。

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<ol><li>Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+CAR+T-cell+therapeutics+for+hematologic+malignancies%3A+Interpreting+clinical+outcomes+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date.</a> Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).</li>
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<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+and+assessment+of+therapeutic+cargo+in+engineered+exosomes%3Aa+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Encapsulation and assessment of therapeutic cargo in engineered exosomes:a systematic review.</a> J Nanobiotechnology. 22 (1), 18(2024).</li>
<li>Basyoni, A. E., Atta, A., Salem, M. M., Mohamed, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+exosomes+for+targeted+drug+delivery+systems+to+combat+brain+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Harnessing exosomes for targeted drug delivery systems to combat brain cancer.</a> Cancer Cell Int. 25 (1), 150(2025).</li>
<li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+separation+and+purification+of+exosomes+using+ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Large-scale separation and purification of exosomes using ion-exchange chromatography.</a> Biomed Res Ther. 11 (4), 6348-6356 (2024).</li>
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<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-EGFR+ScFv+functionalized+exosomes+delivering+LPCAT1+specific+siRNAs+for+inhibition+of+lung+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22JNB%22%5BJournal%5D)">Anti-EGFR ScFv functionalized exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases.</a> JNB. 22 (1), 159(2024).</li>
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<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+CAR+T+cell+therapy+targeting+BCMA+and+CD19+in+relapsed%2Frefractory+multiple+myeloma%3Aa+phase+I%2FII+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bispecific CAR T cell therapy targeting BCMA and CD19 in relapsed/refractory multiple myeloma:a phase I/II trial.</a> Nat Commun. 15 (1), 3371(2024).</li>
<li>Roddie, G., Amrolia, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+CAR-T+cells+for+B-cell+acute+lymphoblastic+leukaemia+and+B-cell+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Dual targeting CAR-T cells for B-cell acute lymphoblastic leukaemia and B-cell non-Hodgkin lymphoma.</a> Blood Adv. 9 (4), 704-721 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><ストロング>素材</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4</td><td>ギブコ</td><td>10010049</td><td>EVのエンリッチメント</td></tr><tr><td>1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>シグマ</td><td>L3771-100G</td><td>SDSパウダー1gを超純水10mLに溶かす</td></tr><tr><td>1x トリス緩衝生理食塩水、Tween-20 (TBST)</td><td>サーモサイエンティフィックケミカルズ</td><td>J77500です。K2</td><td>超純水で希釈して1x溶液を作る(または、0.1%ポリソルベート-20/トゥイーン-20溶液を1xトリス緩衝生理食塩水で調製する)</td></tr><tr><td>96ウェル透明平底ポリスチレンTC処理マイクロプレート、滅菌</td><td>コーニング</td><td>3595</td><td>In vitro機能アッセイ</td></tr><tr><td>Bolt Bis-Tris Plus ミニプロテインゲル、4-12%、1.0 mm、WedgeWell フォーマット</td><td>インビトロゲン</td><td></td><td>セル/EVの特性評価</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A9647-100G</td><td>セル/EVの特性評価</td></tr><tr><td>カルネキシン抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2433秒</td><td>セル/EVの特性評価</td></tr><tr><td>CAR-NK/T細胞</td><td>プロマブバイオテクノロジーズ</td><td>異なります</td><td>CAR細胞外リガンド結合ドメインは、レシピエント細胞上の好ましい標的に依存します</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution 細胞増殖アッセイ (MTS)</td><td>プロメガ</td><td>G3580型</td><td>In vitro機能アッセイ</td></tr><tr><td>cOmplete、ミニ、EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>11836170001</td><td>細胞溶解</td></tr><tr><td>ECLウェスタンブロッティング検出試薬</td><td>アマルサム</td><td>RPN2232</td><td>セル/EVの特性評価</td></tr><tr><td>溶出バッファー</td><td>イノビック</td><td></td><td>EVの濃縮/絶縁</td></tr><tr><td>平衡バッファー</td><td>イノビック</td><td></td><td>EVの濃縮/絶縁</td></tr><tr><td>EXO-ACE IEXカラム</td><td>イノビック</td><td></td><td>下流機能アッセイのためのEV濃縮/単離 特許ID AU2024901931</td></tr><tr><td>EXO-NETパンエクソソームキャプチャービーズ</td><td>イノビック</td><td></td><td>下流特性評価のためのEV絶縁 特許ID WO/2014/011673</td></tr><tr><td>グランザイムB抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4275</td><td>セル/EVの特性評価</td></tr><tr><td>ヒトIL-2 IS、プレミアムグレード</td><td>ミルテニー・バイオテック</td><td>130-097-744</td><td>T/NK細胞の異種フリー培養</td></tr><tr><td>iBlot 2転写スタック、PVDF</td><td>インビトロゲン</td><td></td><td>セル/EVの特性評価</td></tr><tr><td>イムノカルト-XF(cGMP)</td><td>幹細胞技術</td><td>100-0956</td><td>T/NK細胞の異種フリー培養</td></tr><tr><td>K-562型</td><td>ATCCの</td><td>CCL-243</td><td>In vitro機能アッセイ</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCCの</td><td>HTB-22</td><td>In vitro機能アッセイ</td></tr><tr><td>Millex-GPシリンジフィルターユニット、0.22&マイクロ。m</td><td>メルク・ミリポア</td><td>SLGPR33RS</td><td>ターミナルフィルトレーション</td></tr><tr><td>再生バッファー</td><td>イノビック</td><td></td><td>EVの濃縮/絶縁</td></tr><tr><td>RIPAバッファ(10倍)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9806</td><td>細胞溶解</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td>ギブコ</td><td>15250061</td><td>細胞生存率と密度の評価</td></tr><tr><td>洗浄バッファー</td><td>イノビック</td><td></td><td>EVの濃縮/絶縁</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動セルカウンター</td><td>インビトロゲン</td><td>伯爵夫人 II フロリダ州</td><td>細胞生存率と密度の評価</td></tr><tr><td>卓上自動抽出装置</td><td>インビトロゲン</td><td>KingFisher Apexシステム</td><td>ハイスループット自動精製システム プロトコルの詳細についてはリンクを参照してください:https://www.inoviq.com/site/technology/resources</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオオブザーバー7</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ナノ粒子追跡分析(NTA)</td><td>パーティクル・メトリックスGmbH</td><td>ゼータビュー PMX-130</td><td>粒子分析</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>BMGラボテック</td><td>スペクトロスターナノ</td><td>In vitro機能アッセイ</td></tr><tr><td>冷蔵卓上遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アバンティ J-15R</td><td>細胞培養&EV濃縮処理</td></tr><tr><td>SDS-PAGEミニゲルタンク</td><td>インビトロゲン</td><td>A25977</td><td>セル/EVの特性評価</td></tr><tr><td>ウェスタンブロット転写システム</td><td>インビトロゲン</td><td>アイブロット2</td><td>セル/EVの特性評価</td></tr></tbody></table>

キメラ抗原受容体細胞外小胞 (car-ev) 技術の強化: がん治療の未来

Enhancing Chimeric Antigen Receptor-Extracellular Vesicles (CAR-EV) Technology: The Future of Cancer Therapy

CAR T/NK細胞培養とそれに続くEVの単離、特性評価、および機能アッセイにおけるEVの利用の典型的なワークフローを 図1に示します。CAR T/NK細胞の培養からのCMは、EV濃縮および下流の特性評価(ナノ粒子追跡分析を含む)およびマルチウェルプレートMTSアッセイ を介して 機能活性を評価する前に収集されます(図1)。
GFPタグ付きCAR細胞は、顕微鏡 で 視覚化し、培養中のCARコンストラクトの発現を確認できます。顕微鏡検査は、十分な形質導入効率を確保するために、CMの収集前および収集中に日常的なステップとして実行する必要があります。効率を評価する際には、潜在的な自家蛍光を捕捉するために、明視野チャネルとGFPチャネルをオーバーレイすることが重要です。注目すべきは、T細胞は自然に凝集する傾向があり(NK細胞でも同様に観察、データは示していません)、細胞が凝集した表現型を示すと蛍光がはっきりと観察できます(図2)。
EV 濃縮後、EV は NTA とウェスタン イムノブロッティング によって 特徴付けることができます。NTAを使用して、粒子収量の分析により、CMと比較して、単離されたEVの濃度の増加を確認できます(図3A)。ウェスタンブロットデータは、CAR細胞およびEVにおける細胞溶解マーカーグランザイムBの発現、および後者におけるカルネキシンの欠如をさらに確認し、調製物に細胞物質が存在しないことを確認しています。HEK293T細胞はCAR陰性対照として含まれます(図3B)。
EV 機能の分析は、細胞生存率/増殖能力を決定するために MTS アッセイ を介して 実行されました。MCF-7 乳がんおよび K562 血液がん細胞の生存率と増殖に対する EGFR および HER2 標的 CAR-EV の効果は、490 nm の吸光度 (バックグラウンド信号の除去後) での比色 MTS 試薬の測定によって決定されます。この例では、CAR-EVを標的とするEGFRは、MCF-7とK562の細胞生存率をそれぞれ70%と40%低下させました。CAR-EVを標的とするHER-2は、MCF-7を~10%減少させました(スチューデントのt検定 によって 決定されました)。実験レイアウトを考慮すると、ノンパラメトリック検定(マンホイット ニーUなど)を採用すると、その後の研究でより堅牢な洞察が得られる可能性があります(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig1.jpg"> 
図1:CAR-EVの生成、エンリッチメント、EV特性評価、および機能読み出し。 機能解析前のEVの生成、製造、および濃縮CAR-EVサンプルの特性評価の典型的なワークフローを示す概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig2.jpg"> 
図2:HER2を標的とするCAR-T細胞におけるGFP発現の確認による代表的な顕微鏡分析。 画像は、20倍の対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡 で 撮影されました。白いスケールバーは50μmの長さを表します。T細胞は、単一細胞に剥離する前に塊状に増殖する自然な傾向があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig3.jpg"> 
図3:CAR細胞とEVの特性評価。 (A)CAR-T CMおよび濃縮EVのナノトラッキング粒子分析。EVの粒子濃度はCMの1.6〜2.1倍であり、タンパク質濃度は&gt;80%減少しました。統計的に有意な差は、一元配置分散分析と Tukey の多重比較検定でテストされました。 p≤ 0.001、**** p≤ 0.0001。(B)形質導入されたT細胞と濃縮されたCAR-EVのウェスタンブロット分析により、CAR細胞とEVの両方に細胞溶解性グランザイムBの存在が確認されましたが、HEK293T非CAR細胞では欠如が認められました。カルネキシンはCAR-EVでは検出されず、小胞体粒子による汚染が少ないことが示されました。レーンあたりのタンパク質負荷 = 5 μg。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig4.jpg"> 
図4:標的細胞の生存率(MCF-7乳がん細胞およびK562慢性骨髄性白血病細胞株)に対するCAR-EVの効果。 標的細胞は、4.5 x 105 および2.5 x 105 EVs/細胞(それぞれEGFRまたはHER2 CARS)または対照(EVバッファー)の単回投与で最大3日間処理されました。(A)EGFRを標的とするCAR-EV細胞。(B)HER2を標的とするCAR-EV。両方の細胞株で吸光度測定値の低下(治療効果を示す)が観察されました。データは、SD (n = 3) ±平均吸光度を表し、両側対応のないスチューデントの t 検定を使用して分析され、 p 値は統計的有意性を示します。** p≤ 0.01。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

キメラ抗原受容体細胞外小胞 (CAR-EV) 技術の強化: がん治療の未来

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