腫瘍細胞の1型従来の樹状細胞様細胞への扱い可能な in vivo 再プログラミング

私たちは、新しい免疫療法戦略として、がん細胞のcDC1様細胞へのin vivoプログラミングを研究しています。このアプローチが免疫性の冷性腫瘍を免疫性の温性腫瘍に変換し、それによって抗腫瘍免疫を発表できるかどうかを明らかにすることを目指しています。腫瘍内で直接がん細胞を免疫原性cDC1様細胞に変換するプロトコルを提示することにより、現在のin vivo cDC1生成戦略の限界に対処し、cDC1駆動免疫応答のin situ研究を可能にします。

当社の扱いやすい in vivo プログラミング プロトコルは、抑制性腫瘍微小環境を克服して成熟免疫原性 cDC1 様細胞を確実に生成し、これらの細胞は in vivo で直接生成されるため、このアプローチにより in vitro 免疫細胞製造の必要性がなくなります。私たちの発見は、in vivo転写因子を介したリプログラミングを臨床に翻訳するための基盤を確立し、持続的な抗腫瘍免疫応答を誘発する既製でありながら個別化されたがん免疫療法を導入します。今後、cDC1様細胞のリプログラミングがどのように三次およびインフラストラクチャの形成を誘発できるか、そしてこれが体液性免疫に変換されるかどうかを調査しています。

さらに、他の免疫療法アプローチとの潜在的な相乗効果も調査しています。まず、HEK 293T細胞が70〜80%のコンフルエンシーに達するまで培養します。次に、トランスファープラスミドを含む調製したトランスフェクションミックスを1分間完全にボルテックスし、混合物を室温で15分間インキュベートして、DNA脂質複合体の形成を可能にします。

HEK 293T細胞から培地を吸引し、ペニシリンストレプトマイシンを含まない10ミリリットルのDMEMを加え、10%FBSを添加します。次に、トランスフェクションミックスを150ミリメートルのプレートに滴下し、5%の二酸化炭素とともに摂氏37度で16時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を1ミリモル酪酸ナトリウムを添加した20ミリリットルのDMEM完全培地と交換し、細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。

次に、トランスフェクション後48時間と60時間で、レンチウイルス含有上清を50ミリリットルの円錐形チューブに回収します。最初の収集後、2回目の収穫のために、150ミリメートルのプレートあたり12ミリリットルの予熱された完全DMEMを追加します。収集した液体を0.45マイクロメートルの低タンパク質結合ポリエーテルスルホンフィルターでろ過します。

37グラムのレンチウイルス含有培地を38.5ミリリットルのオープントップ薄肉ポリプロピレンチューブにピペットで入れます。スイングバケットローターで25, 000 Gで摂氏4度で90分間チューブを遠心分離します。遠心分離後、ペレットを乱すことなく上清を吸引します。

オープントップの薄肉ポリプロピレンチューブを実験用ワイプまたは同様の吸収性材料の上に逆さまにして5分間置き、余分な液体を排出し、ペレットを乾燥させます。次に、HEPESまたはPBSを添加した200マイクロリットルの氷冷DMEMを各ペレットに加え、混合物を50ミリリットルの円錐形チューブに入れた微量遠心チューブに移します。ペレットを摂氏4度で一晩インキュベートして、完全な再懸濁を可能にします。

再懸濁したすべてのペレットを1つの容器に結合し、ウイルスストックを50〜200マイクロリットルの少量に分注し、長期使用のために摂氏マイナス80度で保存します。がん細胞増殖後、形質導入のために細胞懸濁液を準備して、3日目にEGFP陽性細胞とEGFP陰性細胞のほぼ1対1の比率を達成します。ポリブレン1ミリリットルあたり8マイクログラムを細胞懸濁液に加え、続いて、以前に決定したように適切な量のレンチウイルスを加えます。

気泡を発生させずに中身を優しく混ぜます。次に、10倍の5細胞の乗を含む調製した細胞懸濁液2ミリリットルを6ウェル組織培養プレートの各ウェルにピペットで入れ、摂氏37度で5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。24時間後、レンチウイルス含有培地を各ウェルから除去します。

PBSでウェルを2回洗浄します。各ウェルに500マイクロリットルのトリプシンを加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。次に、ウェルを光学顕微鏡で調べて、プレートから細胞が完全に剥離していることを確認します。

次に、完全な培地を使用して細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに収集します。細胞を350 Gで5分間遠心分離してペレット化します。ペレットをPBSで洗浄します。

アリコートを取り、血球計算盤とトリパンブルー染色を使用して生細胞数を評価します。次に、最終細胞ペレットを氷冷PBSに再懸濁して、腫瘍あたり50マイクロリットルで6細胞の1〜2倍の10乗に相当する10乗の2〜4倍の濃度を達成します。細胞を氷の上に置き、動物実験エリアに移動します。

CD45.1マウスを麻酔した後、低体温症を防ぐために加温パッドの上に置きます。マウスにアイクリームを塗布して、麻酔中の眼の脱水症状を防ぎます。カミソリを使用して、マウスの右脇腹を剃ります。

オプションで、イヤークリッパーでマウスに印を付けます。剃った部分を消毒し、70%エタノール浸漬綿棒で残った毛を取り除きます。次に、P1000ピペットを使用して、がん細胞を完全に再懸濁します。

完全に再懸濁した細胞懸濁液を、30ゲージの針が取り付けられた0.5ミリリットルのシリンジにロードします。マウスの剃った脇腹の皮膚を2本の指でそっと持ち上げ、持ち上げた皮膚によって形成されたしわに注射器の針先を挿入します。片手で注射器を所定の位置に保持しながら、持ち上げた皮膚を解放します。

もう一方の手で、2本の指で皮膚の上部を伸ばします。50マイクロリットルのがん細胞懸濁液をゆっくりと注入して、注射部位に目に見える楕円形の皮下腫れを作ります。注射手順の後、動物が麻酔から完全に目覚めるまで動物を監視して、生存を確保します。

SFFV-PIB-eGFPプラスミドをトランスフェクトしたHEK 293T細胞は、トランスフェクションの24時間後に明確なeGFP発現を示し、血漿送達の成功を確認しました。形質導入の72時間後、黒色腫細胞は、リプログラミング因子とeGFPの送達に成功したことを示しました。細胞の移植後9日目に、in vivoリプログラミングにより、完全に再プログラムされたCD45陽性、MHC-II陽性、cDC1様細胞の割合がin vitro条件よりも高くなりました。

移植後3日目に、PIB-eGFP腫瘍はeGFP対照よりも著しく高いCD45陽性免疫細胞浸潤を示し、早期の免疫リモデリングを示しています。9日目までに、腫瘍領域あたりのCD45平均蛍光強度は、対照よりもPIB-eGFP腫瘍で有意に高いままでした。PIB-eGFP腫瘍では、9日目までに三次リンパ構造が検出可能になり、腫瘍微小環境における構造的免疫変化が示されました。