麻酔ラットにおける末梢疼痛ブロックを評価する電気生理学的手法
2025年11月21日
ここでは、急性麻酔下のin vivo ラット実験において、神経線維サブタイプの活動を識別できる2種類の脊椎電気生理学的測定、局所場電位(局所場電位)と広ダイナミックレンジ単一ニューロン記録を用いて末梢神経における感覚軸索の活性化とブロックを評価する方法を提示します。
私たちの研究の目的は、痛み治療のための末梢電気的および近赤外線神経ブロックの開発です。直流や高周波交流電気ブロック、近赤外光バイオモジュレーションなどの技術は、臨床的な痛み緩和の可能性を提供します。まず、麻酔をかけたラットを手術台に仰向けに置きます。
ラットを仰向け状態で挿管し、14ゲージのアンジオカテーテルのシースと、ミラーサイズの0または0.0ブレードを持つ喉頭鏡を用います。尾の外側をぬるま湯で洗浄し、その後70%イソプロピルアルコールを洗います。次に、22ゲージの静脈内カテーテルを使って外側尾尾静脈をカテーテルで挿入します。
次に、カテーテルを使った尾部静脈に約1ミリリットルの無菌生理食塩水を注射します。ポリエチレンチューブを使い、挿入した尾静脈カテーテルをロクロニウム溶液入り注射器に、注射器ドライバーに取り付けた1ミリリットルあたり2ミリグラムの量で接続します。ラットの左側面の尾端肋骨を触り、背側に沿って脊椎まで探します。
メスを使い、この点を中心に約60ミリメートルの長さの正中切開を入れます。メスを使って棘突起の組織をこすり取る。次に、ハサミで肋骨を露出させ、尾側の肋骨の一番の位置を特定します。
肋骨の位置は、3.5倍から45倍の拡大率の外科用顕微鏡下での鈍的解剖を用いて、目と触覚で確認してください。T13の棘突起には永久マーカーで印をつけてください。その後、鈍的剥離を行い、T11椎骨とL4椎骨の両側にポケットを作ります。
立体走位プラットフォームのTトラックに基座マウント付きの垂直ポスト2本をスライドさせ、締めずにT11およびL4椎骨に合わせます。椎骨クランプの円筒状軸をポストクランプに挿入しますが、まだ締めないでください。T11椎骨から始め、歯のあるピンセットで脊椎を保持します。
脊椎の両側に顎をT13椎骨から約45度離して挿入し、顎を締めます。ポストクランプのスパインクランプのシャフトを締めます。次に、両方のポストクランプを持ち上げて脊椎を持ち上げ、胴体が完全に脊椎クランプで支えられるようにします。
次に、T13およびL1棘突起の尾部位置を、脊椎の外側の筋肉表面に単一縫合糸を挿入してマークします。T12からL3の間の椎骨の薄板の表面から、鉗子、ハサミ、メスを使って筋肉と結合組織を取り除きます。外科用顕微鏡下で、フリードマン・ピアソン・ロンジュールを使ってL2からT13までの椎板を除去します。椎板切除術は、ロンジュールを水平に近づけ、L2の尾部がL3と重なる部分から小さく噛みつくことから始めます。椎弓切除術を前方に延長し、脊髄の正中を露出させ、脊髄への圧力を避け、ロンジュールから骨片を定期的に除去します。
椎板切除術を脊髄の正中線の両側から外側に2ミリメートル延長します。次に、細かい鉗子とスプリングハサミを使って露出した脊髄から硬膜を除去します。切開をする前に硬膜を色付けしてください。
最初のカットの後、少量の脳脊髄液を流し、ねじった糸くずのない組織で優しく浸します。次に、残りの硬膜の一部を除去します。露出した椎板切除部位を生理食塩水で湿らせた組織で覆い、電気生理学のセッションが始まるまで続けてください。
坐骨神経を刺激するには、神経を露出させ、1×3ミリメートルの接点を露出させた特注の双極プラチナJCスタイル電極をその周囲に配置します。次に、露出した神経の隣に神経ブロック装置を置きます。プランター刺激には、13ミリメートルのステンレス製針電極を2つ挿入します。1つは5指の内側、もう1つは4本目の外側に、後足のプランター面近くに置きます。
広ダイナミックレンジのニューロン記録を行う場合は、後足のプランター面を刺激するか、神経カフ電極を使って坐骨神経を直接刺激します。局所的な電位記録では、広範囲信号を避けるために坐骨神経に直接刺激を加えます。電気生理学的信号を記録するために、脊椎と平行に位置する21ゲージの1.5インチ注射針を脊椎の両側の筋肉に挿入します。
電気生理信号を継続的にデジタル化し、リアルタイムで表示します。局所電位記録のために、前端尾方向に電極アレイを挿入し、T13棘突起をマークする縫合糸をできるだけ正中線に近づけつつ、正中血管を損傷しないようにします。録音された信号を監視しながら刺激パラメータを調整してください。
末梢神経ブロックについては、炭素分離されたインターフェース神経電極を用いて、刺激カフの側面に近い坐骨神経に0.1から5ミリアンペアのカタルシス直流電流を流します。もし現在、ブロックがA線維とC線維の両方に誘導され、直流電流適用期間中の局所電位信号面積の減少とほぼ同じ速度で誘導されます。ブロックからの回復はファイバーの種類によって異なります。C線維は回復が速かったが、A線維は遅かった。
長いレイテンシのCファイバーはブロックに時間がかかりましたが、短いレイテンシのCファイバーよりも早く回復しました。この技術を用いることで、ブロックの誘導速度とその後の神経の正常な伝導回復を評価できます。行動評価と比較して、当社の電気生理学的手法により、神経ブロックが神経線維のさまざまなクラスに与える影響をより正確に定量化できます。
今後の研究は、運動制御に関与する軸索のブロックを最小限に抑えつつ、選択的ブロックに焦点を当てます。
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概要
本記事では、後肢の感覚神経活性化の研究および、上行性の疼痛信号を遮断する治療的介入の有効性を評価するため、ラット脊髄の腰部から行うin vivo電気生理学的記録技術について詳細に解説します。このプロトコルには、外科的準備、データ収集、ならびに局所電位（LFP）および広ダイナミックレンジ（WDR）単一ニューロン記録の解析が含まれており、これにより神経線維のサブクラスの区別や神経ブロック様式の評価が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 疼痛研究
背景
- ラット脊髄からの電気生理学的記録により、感覚信号の伝達および疼痛メカニズムに関する知見が得られます。
- LFPおよびWDR記録を用いることで、伝導速度に基づいた神経線維型の識別が可能です。
- これらの手法を用いて、治療的な神経ブロック介入の評価を行うことができます。
- 行動評価と比較して、神経ブロックの効果を精密に定量化することが可能です。
研究の目的
- ラットにおける感覚神経の活性化および神経遮断効率を評価するための電気生理学的手法を開発し、検証する。
- 電気刺激に対する神経線維サブクラス（Aα/β、Aδ、C線維）の活性化を区別する。
- さまざまな疼痛遮断様式の時間的特性を評価する。
使用方法
- 麻酔下ラットにおける、椎弓切除および坐骨神経露出を含む外科的準備。
- 坐骨神経または足底への刺激電極（バイポーラカフ電極または針電極）の留置。
- 腰髄からの局所フィールド電位および広ダイナミックレンジ単一ニューロン活動の記録。
- 神経ブロック介入の適用：直流、キロヘルツ周波数の交流、および光バイオモジュレーション。
主な結果
- LFP記録ではAα/β線維とC線維を区別できますが、Aδ線維は区別できず、坐骨神経全体の活性化データが得られます。
- WDR記録では、高いS/N比の活動電位スパイクにより、Aα/β、Aδ、およびC線維の活動を区別できます。
- 直流神経ブロックにより、A線維とC線維の両方において同程度の割合でブロックが誘導されました。回復はC線維で速く、A線維で緩やかでした。
- 電気生理学的手法を用いることで、神経ブロックの誘導および回復ダイナミクスの精密な測定が可能です。
結論
- in vivo脊髄電気生理学により、感覚線維の活性化および神経ブロックの効果を詳細に検討することが可能です。
- これらの手法は、行動評価よりも精緻な定量化を可能にします。
- 今後の研究では、運動機能を維持しつつ、疼痛線維を選択的にブロックすることを目指しています。
よくある質問
産業界における重要性
麻酔下の大鼠における末梢痛遮断の電気生理学的評価は、感覚神経線維レベルでの神経遮断介入を評価するための、定量的かつメカニズムに基づいたアプローチを提供します。この手法は、線維特異的な遮断および回復動態の直接測定を可能にすることで、早期段階の鎮痛薬開発における予測精度を向上させます。これらの技術を創薬パイプラインに統合することで、リスクを調整した新規疼痛治療薬およびデバイスベースの介入の進展を支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 候補となる介入による疼痛経路変調の直接的な検証を可能にします。
- 線維型特異的な電気生理学的リードアウトを通じて、メカニズムに基づいたリスク低減をサポートします。
- 末梢疼痛遮断戦略のための機能的なターゲットバリデーションを促進します。
- ポートフォリオの選別および優先順位付けのための定量的なエンドポイントを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 神経遮断の有効性を再現可能な形式で評価するための、検証済みin vivoモデルを確立します。
- 化合物またはデバイスのスクリーニングにおいて、標準化された定量的なアウトプットを提供します。
- Aα/β、Aδ、およびC繊維の反応を分化させ、アッセイの特異性を可能にします。
- 疼痛調節プログラム全体での拡張性とプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 前臨床的なリードアウトを、疾患に関連する感覚神経線維の活性化プロファイルと整合させます。
- メカニズムの解明からトランスレーショナルなバイオマーカー開発までの連続性を提供します。
- 疼痛治療薬および神経調節デバイスにおける、リスク調整済みの進展判断に情報を供します。
- 遮断および回復キネティクスを定量化することで、臨床応用への予測価値を高めます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この電気生理学プラットフォームは、疼痛遮断介入における初期探索、リード化合物の同定、および前臨床検証を橋渡しするものです。
- 探索生物学： 繊維特異的な疼痛信号の遮断および回復に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 候補物質の評価に向けて、神経ブロックの有効性に関する再現性のある定量的測定を提供します。
- 分析： 伝導ブロック、回復、および繊維型選択性の精密な測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 前臨床での有効性を、ヒトの疼痛経路に関連する機序的バイオマーカーと整合させます。
- 企業での再利用： 多様な疼痛調節戦略および介入様式に適用可能な、再利用可能なin vivoプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：疼痛ターゲットのバリデーションにおける予測信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：標準化され、再現性と拡張性のある電気生理学的評価を提供します。
- 戦略的価値：定量的かつ線維特異的なデータを提供することで、go/no-go判断の精度と資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整に基づいた疼痛ブロック候補物質の優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の検討事項
- in vivo 電気生理学および外科的手技の専門知識が必要です。
- リアルタイムの信号収集および解析のための専用機器が必要です。
- 刺激および記録プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 標的とする神経や動物モデルに応じて、調整が必要になる場合があります。
- 準備時間は、1回の介入セッションにつき約5時間に制限されています。
