SCAnED - 表皮および真皮皮膚コンパートメントにおける半自動細胞および核検出のためのオープンソースの皮膚セグメンテーションマクロ

私たちの研究では、分子、細胞、構造、機械レベルで組織の恒常性を維持する調節機構を調査しています。私たちの目標は、皮膚の炎症やがんなどの病理学的状態を理解することです。新しい高解像度イメージングおよびマルチオミクスツールにより、組織内の細胞および遺伝子発現変化を2Dおよび3Dでマッピングできるようになりました。

これは病気の発生と進行の理解を大きく広めています。現在の大きな課題の一つは、高度な顕微鏡によって生成される膨大なデータです。画像分析用のツールは増えていますが、経験が浅い人には使いやすくなったり、かなり高価だったりします。

当プロトコルは、表皮と真皮の両方の人間の皮膚細胞を分析するための無料で使いやすいツールを提供します。一般的なツールよりも精度を向上させ、コーディングや画像解析の経験を必要としません。まず、免疫蛍光画像をフィジーまたは画像Jで開き、バイオフォーマットでデフォルト設定を保ちます。

このステップではチャンネルを分割しないでください。SCAnEDマクロをダウンロードしてプラグインを選択して実行してください。次にマクロと「ラン」をクリックします。

プロンプトが出たらSCAnEDのマクロスクリプトファイルを選択します。マクロの画面上の指示に従ってください。マクロの指示でE-cadherinチャンネルを選択してください。

次に画像に移動し、「調整」を選択し、次に「しきい値」を選択してE-カデリンチャネルのしきい値を手動で調整します。表皮領域が完全に撮影されたらOKをクリックします。その後、セグメントを進めるよう促されたらDAP-Eチャネルを選択します。

しきい値関数を用いる際、核の分割強度レベルを自動で定義します。StarDistの場合は、Image Jのプラグインを開きます。核検出モデルをStarDistのグラフィカルインターフェースに読み込み、核チャネルをクリックして解析を選択してください。次に、StarDistでタイル設定を調整して、予想されるパッチサイズである256×256ピクセルに合わせます。

促されたら「はい」を選択して核内のマーカー強度を測定します。その後、各蛍光チャネルごとに分割と解析プロセスを繰り返します。すべてのチャネルが処理された後、マクロの指示に従い出力データをカンマ区切りの値ファイルとして保存します。

細胞質領域では、しきい値関数を用いて核の断片が行われた後、二項拡張を適用して関心のある核領域を拡大します。StarDistが核の断片化に使用された場合、関心のある核領域に拡大拡張を適用します。セル全体のマーカー強度を測定する際に「はい」を選択してください。

その後、マクロ命令に従ってカンマ区切られた値形式で保存します。アイソタイプ対照サンプルを用いてマーカー特異的な強度閾値を確立します。適切なJupyterノートをダウンロードし、Google Collabでファイルを選択し、次にノートブックを開いてください。

ファイルを選び、コードセルを順番に実行します。ファイル選択オプションが表示されたら、ボタンをクリックしてコンマ区切られた値をアップロードします。各抗体に対して、アイソタイプコントロールファイルを使って平均蛍光強度を計算します。

カットオフ閾値を決定するには、ドットプロットノートを開き、アイソタイプの制御データをアップロードしてコードを実行します。アイソタイプコントロールおよび特異的抗体データのプロット上の点分布に基づき、背景信号と真のマーカー発現を区別するための強度閾値を選択します。この閾値を使って、与えられたマーカーに対して各セルを正か負に分類します。

最後に、Google Collabノートブックでドットプロットコードを実行し、マーカーの共発式パターンを可視化するドットプロットを作成しましょう。手動分割画像では、ビメンチン陽性細胞は強い細胞質シグナルを示し、ROI境界が細胞体全体を覆いました。SCAnEDの半自動断片は、閾値および拡張法を用いて類似の境界を持つビメンチン陽性細胞を捕捉しました。

21細胞におけるビメンチン強度の定量比較では、手動分断とSCAnED分断の間に有意な差は認められませんでした。ヒストグラム解析では、乾癬の真皮において健康な肌よりもビメンチン陽性細胞の頻度が高いことが示されました。皮膚細胞の点図解析では、乾癬において健康な皮膚と比較してCD-90陽性ビメンチン陽性細胞が増加しました。

表皮では、乾癬のサンプルでCD-90陽性ビメンチン陰性細胞、恐らくケラチノサイトが健康な皮膚と比べて増加しました。乾癬性および健康な表皮におけるビメンチン陽性細胞数はSCAnEDとQuPathで比較されていました。視覚的分割では、SCAnEDがQuPathよりも表皮に境界細胞を正確に割り当てることが示されました。QuPathは複数の細胞を誤割り当てしていました。