高悪性度漿液性卵巣癌モデリングのための卵管上皮細胞からのマウス由来オルガノイド株の開発

ですので、現在、私たちはプロトコルで示されているような共生性モデルの高悪度漿液性卵巣がんの新規モデルの開発に取り組んでいます。健康なマウスから健康な卵管を取り出し、それをペトリ皿のオルガノイドとして抽出し、通常の人間の病気の中に見られるさまざまな誤差や遺伝子改変を与えます。これは非常に興味深い点で、一方ではペトリ皿内の腫瘍のさまざまな内在因子をオルガノイドとして研究でき、従来の2次元培養よりも現実的です。

しかし、シンジェニックモデルが存在するため、これらのオルガノイドをマウスに戻すことで、腫瘍がどのように発達し、宿主と相互作用するかを見ることができます。これにより、腫瘍や腫瘍発生がどのように起こるのかをより包括的に理解できるようになり、より良いツールや理解が深まることを期待しています。まずは、安楽死した雌のC57ブラック6Jマウスを入手してください。

卵巣と卵管を除去し、無菌のペトリ皿に移植し、4度のペニシリンストレプトマイシンを補足してDMEMを含みます。解剖顕微鏡、細かい鉗子、ハサミを使って卵巣の残留脂肪を取り除きましょう。卵管、漏斗管、遠位膨大の一部を卵巣や子宮から隔離します。

次に、洗浄した組織を消化液が入ったチューブに移します。細いハサミで卵管を0.5ミリ未満の細かい塊に細かく刻みます。その後、37度の温度で40〜50分間培養し、オルガノイド培養を行います。

マウス腫瘍モデルの開発にあたり、5回の注射を設置し、それぞれ400万個の細胞を補充せずにOpti-MEM Iという氷のように冷たい基底膜マトリックスに再懸濁させました。注射準備のために、まず28ゲージの針を装着したU-100インスリン注射器の死体積から空気泡を排出します。その後、40マイクロリットルの細胞をゆっくり注射器に詰め、麻酔が終わるまで注射器を氷の上に置いたままにします。

注射準備が整ったら、注射器を加熱ランプのそばに置き、基底膜マトリックスが温まり粘度を上げて注入と植え付けを助けます。次に、手術の準備として、温めたケージに入れて加熱ランプの下にマウスを入れます。麻酔をかけたマウスの太ももの上に、脇腹に1センチ未満の切開を入れます。

表皮と皮下を切って滑液包の部分に到達します。付属の脂肪パッドを見つけて卵巣を優しく引き抜きます。準備済みの注射器を使い、脂肪パッドと卵巣を通して卵管嚢に細胞を注入します。

卵巣を慎重に滑液包に戻します。編み組みのない縫合糸で筋肉層を閉じます。その後、手術用ホチキスで皮膚切開部を閉じます。

ネズミを温めたケージに戻し、半覚醒するまで、通常15分以上、ヒーターランプで体温を保ちます。マウス卵管上皮由来のオルガノイドは、約5日で明確な球状かつ透明な形状を持ち、10日目から12日目あたりに包装が必要となります。野生型オルガノイドは、レンチウイルスやレトロウイルス遺伝子過剰発現などの遺伝子工学技術を用いて前がん腫瘍に変換されます。

遺伝子組み換えオルガノイド由来の単一クローン細胞株は、卵巣滑液包への注射によって生体内でさらに研究可能です。腫瘍は通常、注射後約60日で2〜3センチメートルの大きさに成長します。ええと、先ほども述べたように、このプロトコルの最大の利点は、もちろんシンジェニックモデルを生成することだと言っていますよね?

ですから、先ほども言ったように、遺伝子が合成しているので、完全な動物、完全なマウスと腫瘍の相互作用を本当に実感できるのです。そして、腫瘍の遺伝学を完全にコントロールできるのです。ですから、もちろん、他のモデルでペトリ皿内の免疫系を理解しようとする場合と比べると、ペトリ皿内の免疫システムを再現するのは非常に難しいでしょう。あるいは、患者から採取した腫瘍サンプルをマウスに投与するPDXを使う場合、マウスに免疫システムがなければ腫瘍を拒絶反応してしまうのですよね?

しかし、このモデルはシンジェニックであるため、宿主全体と腫瘍、特に免疫システムとの相互作用を深く理解できます。免疫システムは現在、この分野で最も注目されている研究分野の一つです。ですから、他のプロトコルと比べてこのプロトコルの最も重要な利点はこれだと思います。実は、私たちはすでにこれらのモデルを使って非常に興味深い現象を調査しています。

私が今特に興味を持っているのは、適応免疫系が、私たちが見てきた限りでは、ゲノム特性、特に高等級の漿液性卵巣がんのコピー数変異に大きく寄与しているように見えることです。つまり、免疫系がなければ、これらの腫瘍は実際にはそれほど大規模で複雑なDNAの再配列を発生させないようです。ですから、私たちはこれがどうやって起こるのか、そしてどうすれば免疫療法を効果的に抑えることができるのかを模索しています。