哺乳類の遺伝子発現を制御するための光誘導システムの迅速な最適化

本プロジェクトは、哺乳類の遺伝子発現のための多成分オプトジェネティクスツールであるLACEを最適化・特徴付けする高スループット手法の開発を目指しています。まず、HEK 293 T細胞を含む細胞培養フラスコをバイオセーフティキャビネット内に置きます。使用済み培地を血清学的ピペットで吸引します。

フラスコの一角に10ミリリットルのDPBSをピペットで注ぎ、そっと回して細胞を洗います。その後、洗浄液を吸引し、DPBSと吸引器の両方を廃棄物容器に処分します。次に、表面を覆うために0.05%トリプシンEDTAを1.5ミリリットル加え、培養します。

フラスコを優しく叩いて細胞を表面から緩めます。次に、8.5ミリリットルの新鮮DMEMをフラスコにピペットで注ぎます。溶液を上下に吸引し、集合体が見えなくなるまでセルを再懸濁させます。

次に、細胞懸濁液9ミリリットルを15ミリリットルの円錐管に移します。フラスコに新鮮なDMEMを9ミリリットル加えます。懸濁液を37度の22濃度下、5%未満まで孵化させます。

次に、懸浮細胞10マイクロリットルとトリプシン染料10マイクロリットルを1対1の比率で混ぜて、ヘモサイトメーターを使って細胞濃度を計算します。高性能1.5ブラック、96ウェル、ガラス底板の各ウェルに約35,000セル、100マイクロリットルの種子をまきます。プレートを37度C、5%二酸化炭素に設定したインキュベーターに24時間入れます。

トランスフェクションでは、まず11マイクロリットルの温かい血清フリーDMEMを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に1ウェル分と10%余分のものにアリコートします。CRY2増強緑色蛍光タンパク質とCIBNガイドRNA/アリコートの様々なプラスミド質量比を、血清フリー培地アリコートを含む各チューブに110ナノグラムの溶液を準備します。その後、各ウェルごとにさらに11マイクロリットルの血清フリーDMEMを別々のチューブにピペットし、トランスフェクション試薬の希釈を行います。

希釈したトランスフェクション試薬をDNA培地混合物に加え、培養してトランスフェクション複合体を形成します。次に、準備済みトランスフェクション複合体をHEK 293 T細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルにピペット20マイクロリットル投与します。96ウェルのプレートをアルミホイルで包み、37度の温度で24時間、24時間二酸化炭素以下で設置したインキュベーターに入れます。

活性化プロセスを開始するには、指定されたスクリプトラインを使って目的の井戸を照らすようにマイクロコントローラ入力コードを修正します。示されたコードラインを使って発光ダイオード強度を9.27ミリワット毎平方センチメートルに設定します。パルス長を1秒に調整し、パルス周波数を0.067ヘルツに設定し、これは15秒ごとに相当します。

オプトプレートの3Dプリントされた蓋に70%エタノールをスプレーします。その後、バイオセーフティキャビネットで乾燥させます。さて、暗室で赤いライトランプをつけて。

96ウェルのプレートをバイオセーフティキャビネットに入れます。プレートの蓋を乾いた3Dプリントの蓋に交換してください。96ウェルプレートをLEDアレイに取り付けて起動装置を組み立てます。

完成したLEDアレイ装置を、37度C、5%二酸化炭素で設定したインキュベーターに24時間入れます。マイクロコントローラー、発光ダイオード、ファンポートを電源に接続します。フローサイトメトリーを行うには、サイトのエキスパートソフトウェアでシステム起動プログラムを実行してください。

サンプルロダーに2ミリリットルの脱イオン水を注入します。提供された品質管理ビーズを使って品質管理を行いましょう。取得用のサンプル井戸を設定し、指定してください。

サイド散乱と前方散乱、サイド散乱の高さと横散乱面積、サイド散乱面積とFITC-A、そしてFITC-A統計表のプロットと表を作成します。次に、Vボトムの960ウェルプレートをサイトメーターのプレートローダーにスナップします。トランスフェクトされていない井戸を選択し、「初期化」をクリックし、「実行」をクリックします。

側散乱とFITC電圧を調整し、関心の集団をSSC-A対FSC-Aプロットに集中させます。「Run」をクリックし、CMV強化された緑色蛍光タンパク質を適切にトランスフェクトしたものを選択します。FITC電圧を調整し、SSC-AとFITCAプロットに自己蛍光細胞と蛍光細胞の両方を含めるようにします。

健康な細胞集団を制限するためのポリゴンを作りましょう。SSC-H対SSC-Aプロット上の二重判別用にゲートへの第二の多角形。蛍光細胞と蛍光しない細胞を区別するために、未トランスフェクト細胞のゲートを基準に多角ゲートを作成します。

200秒経過または1万回のイベントに達するまで、毎分60マイクロリットルのサンプルを自動記録します。その後、平均FITC値をCSVファイルとしてエクスポートし、データを解析します。フローサイトメーターはデイリークリーニングオプションを選択して清掃してください。

蛍光画像では、質量比が1対9の場合、青色光の活性化が最大eGFP発現率を5対5の比と比べて低く誘導し、暗闇条件下では漏れが増加することが示されました。フローサイトメトリーでは、P1におけるゲートイベントの95%以上がすべての条件下で単一発であることが示されました。また、未トランスフェクト細胞のeGFP陽性集団は0.1%未満でした。

CMV-eGFP対照群では約99%のeGFP陽性細胞が見られ、2pLACEトランスフェクト細胞は約57%でした。CMV-eGFPトランスフェクト細胞は明暗条件の両方で強い持続的なeGFP発現を示し、未トランスフェクト細胞では目に見える蛍光はありませんでした。また、2pLACEのトランスフェクションと、CMVeGFPよりも低い発現で青色光下でのeGFP発現の活性化が確認されました。光活性化2pLACEサンプルでは、暗い環境と比べてeGFP発現が3倍に増加しました。

2pLACEトランスフェクトサンプル中のeGFP陽性細胞の割合は約60%でした。質量比3対7は最も高い平均蛍光強度とダイナミックレンジを生み出しました。このプロトコルにより、サンプルの高スループット評価や、光学プレートを用いた技術的な再現が可能となり、光条件やパルス周波数をプログラムできます。