ホールマウント組織イメージングを用いた腸粘液の三次元定量化
September 12th, 2025
この研究では、全マウント腸組織と多光子顕微鏡を使用して分泌された粘液を定量化し、塩化カルバモイルコリンなどの刺激に応答した粘液動態の正確な体積分析と視覚化を可能にする 3D イメージング法を提示します。
私たちの研究は、粘膜組織への微生物注入のメカニズムに焦点を当てており、粘液がこれらの相互作用を調節する上で重要な役割を果たすことを強調しています。従来の2次元粘液の定量化では、空間的・体積的な詳細が見落とされています。当プロトコルは、既存の手法で見落とされていた分子介入による構造的および分布の変化を明らかにし、正確な3D解析を可能にします。
このプロトコルはホルモンイメージングと3D定量化を組み合わせ、従来の2D評価を超えた多様な実験条件や分子介入に適用可能な、腸粘液構造の強固で再現性の高い測定を提供します。まず、6〜8週間の麻酔をかけたマウスを温熱パッドの上に置き、体温を保ちます。マウスの皮膚表面をアルコールで消毒し、左下腹部に切開をして盲腸を露出させつつ麻酔を維持させます。
次に、回腸または近位結腸を特定します。腸ループを滅菌ガーゼにかけてください。無菌PBSで洗い流し、両端を動脈クランプで固定して3センチメートルの閉じたループを作ります。
麻酔下で、結紮された腸ループに200マイクロリットルを超えない無菌PBSまたはカルバモイルコリン塩化物試薬を注射します。30分の処置後、安楽死した動物から腸ループを採取します。鉗子を使って腸ループを持ち、無菌PBSで優しくすすぎます。
腸ループを縦方向に切り開き、切断されていない部分を小さく残し、組織を無菌PBSで再度洗い流します。6センチの皿で組織を平らにし、残りの部分を切り開きます。銅線のセグメントを使ってアガロースの基座に固定します。
次に、4%パラホルムアルデヒド溶液10ミリリットルを加えて、組織を12〜24時間固定します。培養後、パラホルムアルデヒド溶液を除去し、組織をPBSで少なくとも3回洗浄して残留したパラホルムアルデヒドを除去します。次に、組織をPBSに0.4%トリトンX-100および3%BSAを補足したブロッキングバッファー10ミリットルに浸し、4度の温度で12〜24時間保存します。
ブロッキングバッファを取り除きましょう。小麦胚凝集素とファロイジンを含む染料溶液で組織を染色します。PBS処理済みの小腸および大腸組織では、WGA陽性粘液は主に上皮表面のゴブレット細胞内に局在していました。
カルバモイルコリン塩化処理後、腸腔内のWGA陽性粘液の量は小腸および大腸の両方で目に見て増加しましたが、粘液は連続した層を形成するのではなく散発的に分散していました。小腸および大腸の両方でカルバモイルコリン塩化処理後、WGA陽性粘液のゴブレット細胞体積が有意に減少し、能動分泌を示しました。PBS処理組織内のすべてのゴブレット細胞粘液量は1,000立方マイクロメートル未満でした。
1,000立方マイクロメートルを超えるWGA陽性の物質は、腔内分泌粘液として分類されました。カルバモイルコリン塩化処理は、小腸および大腸組織の両方で分泌される粘液の総量を約5倍から20倍に増加させました。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この研究では、全実体組織と多光子顕微鏡法を用いた腸粘液の3Dイメージングのための新しいプロトコルを提示します。これにより、様々な刺激に対する粘液ダイナミクスの正確な体積分析と可視化が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の領域
- 神経科学
- 生物学
- 粘膜免疫学
背景
- 粘液ダイナミクスの理解は、粘膜組織と微生物との相互作用を研究する上で重要です。
- 従来の2D法では、粘液の空間的および体積的詳細を捉えることができません。
- 3D分析により、分子的介入による粘液の構造的変化についての洞察が得られます。
- この研究は、粘液定量化の精度を向上させることを目指しています。
研究目的
- 腸粘液の正確な3D定量化のためのプロトコルを開発すること。
- 粘液の構造的および分布的変化を明らかにすること。
- 様々な実験条件下での腸粘液構造の測定を改善すること。
使用した方法
- 全実体腸組織の準備。
- イメージングのための多光子顕微鏡法。
- ホルモンイメージングと3D定量化の組み合わせ。
- 組織収集のための麻酔マウスの使用。
主な結果
- このプロトコルにより、粘液の堅牢かつ再現可能な測定が可能になります。
- 3Dイメージングにより、従来の2D評価では見逃される詳細が明らかになります。
- 刺激に対する粘液ダイナミクスの構造的変化が観察されます。
- この方法は多様な実験条件に適用可能です。
結論
- この研究は、粘液定量化技術に重要な進歩をもたらします。
- 3Dイメージングにより、微生物との相互作用における粘液の役割についての理解が深まります。
- このプロトコルは、研究における様々な分子的介入に利用可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate three-dimensional quantification of intestinal mucus addresses a critical gap in discovery-stage gastrointestinal research by enabling absolute volumetric and spatial analysis of mucus secretion. This capability enhances predictive confidence in evaluating mucosal barrier function and the impact of molecular interventions, supporting risk-adjusted decisions in early target validation and mechanistic de-risking. The protocol's reproducibility and quantitative outputs position it as a foundational tool for pipeline advancement in mucosal biology and immunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to mucosal barrier integrity and host-microbe interactions.
- Supports functional target validation by quantifying stimulus-induced mucus secretion and distribution.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing structural and volumetric changes in response to molecular interventions.
- Provides robust data for portfolio triage and prioritization of gastrointestinal targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated whole-mount tissue systems for downstream screening of modulators affecting mucus secretion.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative volumetric outputs for assay development.
- Enables scalability and platform reuse across diverse experimental conditions and molecular stimuli.
- Supports reliable evaluation of compound effects on mucus architecture and secretion dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by quantifying mucus dynamics under physiological and pathological conditions.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing absolute quantitative data.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on robust volumetric and spatial readouts.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker development in mucosal research.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative readouts, and mechanistic de-risking in gastrointestinal research workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying mucus secretion in response to defined stimuli.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative volumetric outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers absolute measurements and spatial distribution data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by enabling in situ visualization and quantification of mucus dynamics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform for diverse mucosal research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mucosal barrier research.
- Operational Value: Standardizes volumetric quantification and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of gastrointestinal and mucosal immunology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole-mount tissue preparation and multi-photon microscopy.
- Demands access to advanced imaging platforms and analytical software for 3D quantification.
- Necessitates cross-team standardization of tissue handling and staining protocols.
- Adaptable to various intestinal regions and experimental stimuli with protocol optimization.
- Dependent on precise volumetric thresholds and classification criteria for mucus quantification.
