低密度リポタンパク質の存在下での好中球細胞外トラップを用いた血管内皮細胞の刺激

好中球細胞外トラップは、心血管疾患を含むさまざまな疾患に関与しています。しかし、血管細胞に対するNET形成とリポタンパク質の相乗効果は不明のままです。このプロトコルを利用して、好中球細胞外トラップおよび低密度リポタンパク質で処理されたヒト大動脈内皮細胞で炎症反応がどのように誘発されるかについて、機構分析が現在まで進行中です。

高密度リポタンパク質がNET形成の抑制因子として作用することを実証しました。これは、酸化された低密度リポタンパク質、酸化されたリン脂質、およびリゾリン脂質によって促進されます。まず、ヘパリンチューブで得られた45〜50ミリリットルのヒト全血を700 Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。

スピン後、遠心分離機の速度をゆっくりと下げてから、血漿画分を含む上層を回収します。血漿画分を摂氏4度で700Gで15分間2回遠心分離し、同じ減速設定を維持しながら血球を完全に除去します。次に、血漿1ミリリットルあたり1マイクロリットルの250ミリモルEDTA溶液を加えて、リポタンパク質の二価金属イオン媒介酸化を防ぎます。

2.7ミリリットルの血漿を超遠心チューブに入れます。250マイクロモルEDTAを含む900マイクロリットルのPBSと重ね合わせます。次に、チューブを摂氏4度で7分間、600, 000 Gで超遠心分離します。

次に、最上層から900マイクロリットルを廃棄して、カイロミクロン画分を除去します。残りの血漿の上にEDTAを含むPBS900マイクロリットルを加え、摂氏4度で2.5時間600, 000 Gで超遠心分離します。非常に低密度のリポタンパク質画分を除去するために、最上層の900マイクロリットルを廃棄します。

次に、540マイクロリットルの0.5グラム/ミリリットル臭化カリウム溶液を血漿に加え、密度を1.063に調整します。ピペットと超遠心分離機を使用して内容物を600, 000 Gで摂氏4度で2.5時間穏やかに混合します。低密度リポタンパク質を含む最上層を540マイクロリットル収集します。

収集した画分を透析膜に移し、暗所で摂氏4度のEDTAを含む2リットルのPBSに対して透析し、臭化カリウムを除去します。152マイクロリットルの0.01%ポリリジンまたは0.1%ゼラチン溶液を12ウェルプレートの各ウェルに加え、室温で少なくとも5分間インキュベートします。次に、ウェルから溶液を取り出し、200マイクロリットルの滅菌水で一度洗浄し、ウェルを室温で完全に乾燥させます。

準備したプレートは、さらに使用するまで室温で保管してください。ポリリジンについて示されているのと同じ手順に従って、ゼラチンでコーティングされたプレートを準備します。2マイクロモルのオールトランスレチノイン酸を添加したRPMI-1640培地で10ミリリットルあたり6つのHL60細胞の10乗を2倍培養します。

オールトランスレチノイン酸との4日間のインキュベーションの後、HL60細胞を収集します。収集した細胞を摂氏18〜22度で220Gで4分間遠心分離します。上清を吸引し、同量の無血清RPMI-1640培地で細胞を洗浄します。

洗浄した細胞を摂氏18〜22度で4分間220 Gで再度遠心分離し、無血清RPMI-1640培地に細胞を再懸濁します。細胞濃度を10の2倍に10乗に調整した後、ポリリジンで事前にコーティングされた12ウェルプレートの各ウェルに0.5ミリリットルの懸濁液を播種します。300ナノモルのホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸またはPMAの有無にかかわらず、100マイクロリットルの無血清RPMI-1640培地を追加します。

細胞を30分間培養します。次に、ウェルから培地を取り除きます。無血清RPMI-1640培地で細胞を1回洗浄し、低密度リポタンパク質を1ミリリットルあたり0または20マイクログラムのいずれかを含む無血清RPMI-1640と交換します。

細胞を2時間培養し続けます。各ウェルから培地をチューブに集め、700 Gで摂氏18〜22度で3分間遠心分離して細胞破片を除去します。刺激のために、ヒト大動脈内皮細胞培養物を入手し、使用済み培地を0.5ミリリットルの新鮮な培地と交換し、細胞を30分間インキュベートします。

最後に、好中球細胞外トラップとLDLを含む好中球様細胞から採取した培地167マイクロリットルをヒト大動脈内皮細胞皿に加えます。好中球細胞外トラップによるヒト大動脈内皮細胞の刺激は、丸石のような形状から細長い形状への用量依存的な形態学的変化をもたらしました。ヒト大動脈内皮細胞の形態学的変化は、LDL誘発性好中球細胞外トラップで刺激されると増強され、目に見える伸長は早ければ6時間で明らかになりました。