ナチュラルキラー細胞活性化の迅速なラベルフリー分析のためのフィールド展開可能なレンズフリーイメージングプラットフォーム

私たちの目標は、NK細胞の活性化をリアルタイムで定量化し、ラベルフリー、レンズフリーのイメージングを使用して免疫モニタリングを強化することで、免疫機能を迅速に評価することです。自然免疫指数(I3)は、健康なドナーと免疫不全のドナーのNK細胞活性を確実に区別し、サイトカインおよびフローサイトメトリーマーカーと強く相関することを示しました。既存のNK細胞アッセイでは、ラベル、かさばる機器、長いインキュベーション時間が必要です。

当社のLSITプラットフォームは、シンプルなオプトエレクトロニクスを使用して、高速で手頃な価格のラベルフリープロファイリングを可能にすることで、このギャップを埋めます。当社のラベルフリーLSITプラットフォームは、シャドウパラメータを使用して30秒以内に単一細胞レベルでNK細胞活性化を区別し、染色や高価なフローサイトメトリーの必要性を排除します。LSITを拡張してT細胞とB細胞の活性化を監視し、さまざまな免疫細胞状態のハイスループット分類のためのディープラーニングアルゴリズムを統合します。

まず、ナチュラルキラー(NK)細胞分離用のキットを冷蔵庫から取り出し、摂氏15〜28度の室温にします。磁気分離器、滅菌チップ付きピペットを配置し、インキュベーターまたは加熱ブロックを摂氏37度に設定して、必要な機器を準備します。ピペットを使用して、抗体カクテルが入った緑色のキャップ付き反応チューブに0.5ミリリットルの全血を加えます。

チューブを上下に5〜6回ピペッティングして、内容物を穏やかに混合します。次に、チューブを5分間インキュベートします。緑のキャップのチューブの内容物全体をピペットを使用して赤いキャップの分離チューブに移し、チューブを5〜6回ピペッティングして穏やかに混合します。

赤いキャップのチューブを磁気分離器に置き、室温で10分間インキュベートします。磁石を所定の位置に保ちながら、ピペットを使用して約1.5ミリリットルの上清を紫色のキャップ付き分離チューブ2に移します。チューブを5〜6回ピペッティングして内容物を穏やかに混合します。

次に、紫色のキャップをかぶったチューブを磁気分離器の上に置き、10分間インキュベートします。磁石が所定の位置にある間に、ピペットを使用して約1ミリリットルの上清を灰色の蓋付きの回収チューブに移し、チューブをピペッティングして内容物を注意深く混合します。次に、単離されたナチュラルキラー細胞懸濁液100マイクロリットルをビヒクルチューブに加え、さらに100マイクロリットルを活性化刺激カクテル(ASC)チューブに加えます。

ボルテックスミキサーを使用して両方のチューブの内容物を穏やかに混合し、均一に分散させます。摂氏37度に設定された加熱ブロックまたはインキュベーター内でチューブを1時間インキュベートします。LSIT プラットフォームをオンにします。

LSITキャプチャソフトウェアを起動します。IDとパスワードを入力してログインし、[キャリブレーション]を選択してキャリブレーションモードを開始します。タッチスクリーンの開くボタンを押すか、物理的なスライドドアボタンを使用して引き出しを開きます。

引き出しが開いたら、キャリブレーションスライドを取り外して保管してください。次に、[背景の設定]をクリックして、光学強度を調整します。引き出しのキャリブレーションスライドを元に戻し、引き出しを閉じます。

次に、「キャリブレーションの開始」をクリックしてプロセスを完了します。アッセイスライドをパウチから取り出します。清潔で平らな面に置く前に、サンプルデータでラベルを付けてください。

10マイクロリットルのビヒクルサンプルをチャネルAとBにピペットで入れ、次にASC刺激サンプル10マイクロリットルをチャンネルCとDにピペットで入れます。次に、開くを押して引き出しを取り出します。キャリブレーションスライドを取り外し、収納ボックスに入れます。準備したアッセイスライドを引き出しに挿入し、[閉じる]を押して固定します。

メインメニューに戻り、メイン画面からNK細胞のアクティビティとテストを選択します。サンプルIDを入力するか、バーコードをスキャンしてサンプルプロファイルをロードします。次に、 キャプチャ 画像の記録を開始します。

画像をキャプチャしたら、「分析」をクリックして処理を開始します。画面に表示されたNK細胞活性率と細胞数を確認します。結果をUSBドライブにダウンロードするか、タッチスクリーンメニューを使用して印刷します。

LSITメインインターフェイスで[細胞計数とテスト]を選択します。ピペットを使用して、10マイクロリットルの新しいサンプルを新しいアッセイスライドチャネルにロードします。スライドを引き出しに挿入します。

タッチスクリーンまたはボタンを使用してドロワーを閉じ、システムにサンプルIDを入力します。該当する場合は、タッチスクリーンに希釈係数を入力し、カウントを押して細胞の定量を開始します。マイクロリットルあたりのセルとして画面に表示される結果を表示します。

分析後、[開く]ボタンを押すか、物理スイッチを切り替えてドロワーを開きます。手袋をはめた手を使用して、使用済みのスライドを引き出しから取り外します。最後に、キャリブレーションスライドを引き出しに戻してセンサーを保護し、タッチスクリーンまたは物理トグルスイッチを使用して引き出しを閉じます。

統合ソフトウェアを備えたLSITプラットフォームは、活性化された対照細胞と刺激されていない対照細胞のCSP値を比較することにより、NK細胞の活性化を定量的に評価しました。免疫レポートには要約された統計表が提供されました。ASC刺激は、30分と2時間後にHema 3染色のサイトスピンに見られるように、サイズと細胞質の複雑さの増加を含むNK細胞の明確な形態学的変化を誘発しました。

シャドウ画像は、ASC刺激細胞がビヒクルコントロールと比較して目に見えて複雑な回折パターンを持っていることを示し、抽出されたパラメータはピーク間距離、細胞質粒度、および組み合わせたシャドウパラメータの増加を示しました。シャドウパラメータ値を組み合わせることで、健康なドナーとがん患者を明確に分類することができ、活性化NK細胞と非活性化NK細胞の単一細胞分布の重複は最小限に抑えられました。健康なドナーは、ASC刺激後にがん患者よりも有意に高い自然免疫指数値を示しました。