蛍光脂肪酸類似体を用いた内皮脂肪酸取り込みの定量化
2025年8月15日
このプロトコルは、長鎖および超長鎖飽和脂肪酸のBODIPY-C12およびBODIPY-C16蛍光類似体による刺激時に内皮細胞における細胞脂質取り込みを測定するためのin vitroアッセイを詳述する。この方法は効率的で他の細胞型にも適応できるため、脂質代謝を研究するための有用なアプローチを提供します。
脂肪酸のような血液媒介栄養素は、代謝組織に入るためには、まだ十分に理解されていないメカニズムを通じて毛細血管内皮関門を通過しなければなりません。これらのプロセスを明確にすることで、2型糖尿病などの代謝疾患治療のための新たな治療標的が明らかになる可能性があります。その結果、メス筋と脂肪組織は、内皮脂質の取り込みと輸送を、部分的に内分泌系によって制御されるパラクリン代謝物を使って調節していることがわかりました。
また、ミトコンドリアATPは解糖系ATPに依存していることが知られているにもかかわらず、予想外に内皮脂肪の取り込みに寄与していることもわかっています。本プロトコルで示されたアッセイを用いて、内皮脂肪酸の取り込みと輸送の分子メカニズム、さらに他の組織によってどのように調節されるかをさらに深く探る予定です。まず、2%ゼラチンストック25ミリリットルをPBS475ミリリットルに加え、0.1%ゼラチン溶液を準備します。
ゼラチン溶液を十分に混ぜ、0.2マイクロメートルの真空フィルターまたはオートクレーブでろ過・滅菌します。ピペットを使って、黒い透明底面の96ウェルプレートの各ウェルに0.1%ゼラチン溶液100マイクロリットルを加えます。プレートを37度のインキュベーターに少なくとも30分または一晩置いてください。
培養後、あらかじめコーティングされた96ウェルプレートから余分なゼラチン溶液を取り除きます。皿をPBSで一度洗ってください。その後、各ウェルに細胞懸濁液100マイクロリットルをピペットで送り込み、翌日までに細胞同士が合流に達するようシーディング密度を調整します。
陽性対照として、3-ヒドロキシイソ酪酸と乳酸を20ミリモラー溶液で準備します。陰性コントロールには、微小摩ル1つのニクロスアミドを使います。その後、溶液を別の96ウェルプレートにピペットで移します。
内皮細胞を事前に温めた二価PBSで一度洗浄し、プレート化された細胞を乱さないように急な角度でピペットします。適切な処理試薬を1ウェルあたり50マイクロリットル追加し、37度で30分または60分培養します。BODIPY脂肪酸BSA複合体を調製するには、2マイクロモルのBODIPY脂肪酸溶液と1マイクロモルの無脂肪酸BSAをPBSで混合します。
使用前に室温の暗い場所で10分間孵育してください。次に、処理した各製品に50マイクロリットルのBODIPY脂肪酸BSA複合体を加え、37度で5分間培養します。PBSに脂肪酸を含まないBSAを1マイクロモル溶液で洗浄バッファーとして準備し、37度まで予温します。
BODIPY脂肪酸BSA複合体をウェルから取り出し、50マイクロリットルの予備温めた洗浄バッファーでプレート全体を2回洗浄し、各洗浄ごとに1.5分間行います。次に、各ウェルに0.08%のトリパンブルーを50マイクロリットル加えて細胞外蛍光を消火します。マイクロプレートリーダーを用いて、すぐに細胞内の蛍光を測定します。
トリパンブルー溶液をウェルから取り出した後、細胞をPBSで優しく洗浄します。各ウェルに10%培地で希釈したホエスト染料1ミリリットルあたり4マイクログラムを加えます。プレートを37度で30分間孵化させます。
その後、プレートをPBSで一度洗って余分な染料を落とします。その後、各ウェルに新鮮なPBSを追加し、マイクロプレートリーダーでホーヒスト蛍光を測定します。HUVECおよびEA.hy926細胞の両方において、培養1分、5分、10分のBODIPY-C12シグナルはBODIPY-C12脂肪酸濃度が高いほど有意に増加しました。
乳酸1時間治療により、5ミリモラーおよび20ミリモラー濃度で用量依存的にBODIPY-C12の取り込みが増加しました。3-ヒドロキシイソ酪酸の処理も用量依存的にBODIPY-C12の取り込みを有意に増加させ、最も高い取り込み量は20ミリモルで観察されました。1マイクロモラルニクロサミドを30分間投与したところ、未処理のDMSO対照群と比較してBODIPY-C12の取り込みが有意に減少しました。
HUVEC中のBODIPY-C16による5分間の潜伏後、10ミリモラーおよび20ミリモラーでの乳酸処理が用量依存的に有意に増加しました。1マイクロモルニクロサミドの処理は、未治療のDMSO対照群と比較してBODIPY-C16の取り込みを有意に減少させました。
概要
このプロトコルは、脂肪酸のBODIPY蛍光アナログを使用して内皮細胞における細胞脂質取り込みを測定するためのin vitroアッセイの詳細を示しています。この方法は効率的で適応可能であり、脂質代謝に関する洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 脂質代謝
- 内皮細胞機能
背景
- 脂肪酸は代謝組織に入るために内皮バリアを通過しなければなりません。
- このプロセスのメカニズムはよく理解されていません。
- これらのメカニズムを理解することで、代謝疾患の新たな治療標的につながる可能性があります。
- 以前の知見は、筋肉と脂肪組織が内皮脂質取り込みを調節することを示しています。
研究の目的
- 内皮脂肪酸取り込みの背後にある分子メカニズムを明らかにすること。
- 脂質取り込みが他の組織によってどのように調節されているかを探ること。
- 脂質代謝の詳細な分析のためにin vitroアッセイを利用すること。
使用された方法
- 細胞培養のためのゼラチンコーティング96ウェルプレートの準備。
- 脂質取り込みを測定するためのBODIPY脂肪酸アナログの使用。
- 様々な処置による内皮細胞のインキュベーション。
- 脂質取り込みを定量化するための細胞内蛍光の測定。
主な結果
- 脂肪酸の濃度が高いほど、BODIPY-C12シグナルが増加しました。
- 乳酸と3-ヒドロキシイソ酪酸は用量依存的にBODIPY-C12の取り込みを増強しました。
- ニクロサミド処理は脂肪酸取り込みを著しく減少させました。
- BODIPY-C16の取り込みも乳酸処理によって増加しました。
結論
- このアッセイは内皮細胞における脂質取り込みを研究するための信頼できる方法を提供します。
- 結果は、パラクリン代謝物の潜在的な調節役割を示唆しています。
- さらなる調査により、代謝疾患のメカニズムに関する新しい洞察が得られる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying endothelial fatty acid uptake with fluorescent analogs addresses a critical gap in early metabolic disease research by enabling robust, scalable measurement of lipid transport dynamics. This assay supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage, directly informing portfolio decisions for metabolic and vascular disease programs. Its adaptability and quantitative outputs position it as a reusable platform for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of endothelial lipid transport mechanisms relevant to metabolic disease.
- Supports functional target validation by quantifying chain length-specific fatty acid uptake.
- Facilitates mechanistic de-risking through use of positive and negative controls.
- Provides quantitative data to inform predictive confidence and triage of early targets.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, high-throughput 96-well format for reproducible FA uptake measurement.
- Enables assay scalability and platform reuse across primary and immortalized endothelial cell lines.
- Supports robust compound evaluation with time- and dose-dependent uptake readouts.
- Improves safety and speed compared to radiolabeled tracer methods.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling endothelial transport in metabolic contexts.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting live-cell and pulse-chase formats.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of endothelial lipid handling.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying regulatory mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing, target validation, and translational research in metabolic and vascular disease pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative FA uptake measurements clarify endothelial transport pathways and regulatory mechanisms.
- Screening: High-throughput, reproducible outputs enable compound and pathway screening in validated cell systems.
- Analytics: Fluorescence-based readouts and normalization to cell number provide robust, comparable data across conditions.
- Translational Research: Adaptability to live-cell and pulse-chase formats supports biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Platform versatility allows adaptation to diverse cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in endothelial lipid transport studies.
- Operational Value: Standardizes FA uptake quantification with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic disease targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in endothelial cell culture and fluorescence-based quantification.
- Needs access to microplate readers and compatible imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of controls and normalization protocols.
- Adaptable to various cell types and imaging modalities with protocol optimization.
- Limitations include dependence on analog uptake fidelity and cell line-specific responses.
![の開発と特性評価インビトロ微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca 2+]私と一酸化窒素の生産](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
