Name: RPA/CRISPR/Cas12aシステムへのアルカリ溶解によるトリパノソーマ科寄生虫および Nosema ceranae のオンサイトDNA検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶRPAとCRISPR/Cas12aを組み合わせたミツバチ病原体の現場診断法。アルカリ溶解で簡便にDNA抽出し、従来のQPCRより高感度にLotmaria passimとNosema ceranaeを検出する手法です。

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<li>Aman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iSCAN-V2%3A+a+one-pot+RT-RPA-CRISPR%2FCas12b+assay+for+point-of-care+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">iSCAN-V2: a one-pot RT-RPA-CRISPR/Cas12b assay for point-of-care SARS-CoV-2 detection.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 800104(2022).</li>
<li>Peng, R., Lu, Z., Liu, M., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+for+rapid+and+multiplex+detection+of+respiratory+infectious+viruses+based+on+centrifugal+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-RPA-assisted CRISPR/Cas12a for rapid and multiplex detection of respiratory infectious viruses based on centrifugal microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 399, 134838(2024).</li>
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<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+lyophilized+CRISPR%2FCas12a+and+RPA+assay+for+rapid+detection+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">Application of a lyophilized CRISPR/Cas12a and RPA assay for rapid detection of Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Microchem J. 206, 111443(2024).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+all-in-one+RPA-Cas12a+strategy+with+de+novo+autodesigner+and+its+application+in+on-site+ultrasensitive+detection+of+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses.</a> Biosens Bioelectron. 239, 115609(2023).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6641">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68871">10.3791/68874</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68874">On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

<table><tbody><tr><td>0.2 mL DNAse および RNAse フリーの Eppendorf チューブ</td><td>アクシーゲン</td><td>MTC-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNAseおよびRNAseフリーのEppendorfチューブ</td><td>アクシーゲン</td><td>MTC-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 & ムー;L 低保持フィルターチップ</td><td>ラボクリニック</td><td>5-063-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>100 & ムー;L 低保持フィルターチップ</td><td>ラボクリニック</td><td>5-120-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>1000 & ムー;L 低保持フィルターチップ</td><td>ラボクリニック</td><td>5-203-P4-0</td><td></td></tr><tr><td>BH-200シリーズスチュアートドライブロックヒーター</td><td>コール・パーマー</td><td>EW-36610-00</td><td></td></tr><tr><td>DEPC処理水</td><td>アンビコン</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>EDTAの</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>エンジェン lba Cas12a (Cpf1)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ乳棒</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>ミレニア GenLine HybriDetect</td><td>ミレニア</td><td>MGHD1</td><td></td></tr><tr><td>ナオウ</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>RPAキット TwistAmp Liquid Basic</td><td>ツイストアンプ</td><td>&nbsp;TALQBAS01</td><td></td></tr><tr><td>メスの刃</td><td>スワン・モートン</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>シングルシャネルピペットPIPETMAN P1000Lマイクロピペットメタルイジェクト</td><td>ギルソン</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>シングルシャネルピペットPIPETMAN P100Lマイクロピペットメタルイジェクト</td><td>ギルソン</td><td>F144057M</td><td></td></tr><tr><td>シングルシャネルピペットPIPETMAN P10Lマイクロピペットメタルイジェクト</td><td>ギルソン</td><td>F144055M</td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タッチリアルタイムPCR検出システム</td><td>バイオラッド</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>トリス-HCl</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>ツイストアンプ リキッドベーシック</td><td>捻る</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

rpa/crispr/cas12aシステムへのアルカリ溶解によるトリパノソーマ科寄生虫および nosema ceranae のオンサイトdna検出

On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

ここでは、働きバチ腹部のアルカリ溶解とRPA増幅、および蛍光および/またはラテラルフローアプローチによるCRISPR/Cas12aベースの検出を組み合わせた高速オンサイト法について説明しました。完全なワークフローのスキーマを 図3に、働きバチ腹部のHotSHOTアルカリ溶解のスキーマを 図4に示します。RPA/CRISPR/Cas12aアッセイの代表的な結果を 図5に示します。 L. passim と N. ceranae を検出するために、サーモサイクラーを使用して、FAM 標識プローブを使用して相対蛍光単位(RFU)を定量しました(図 4A)。RPA反応は10 ngのDNAを用いて行い、蛍光データをグラフにプロットしました(図4B)。アッセイの最終段階で、円錐形チューブ内のサンプルをゲルイメージングシステムを使用して撮影しました(図4C)。ビオチン標識プローブで検出するために、サンプルをサーモブロックでインキュベートしました(図4A)。検出溶液は、製造元の指示に従って調製し、ラテラルフローストリップに適用しました(図4B、C)。この方法により、両方のミツバチ病原体の検出に成功しました。
RPA反応の効率を判断するために、この方法を、参照されたキットを使用してミツバチから精製したDNAを使用した標準的なqPCRと比較しました(材料の表を参照)。合計32個のミツバチのサンプルを、両方の方法でL. passimのβ-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーで試験し、その後、蛍光プローブのCRISPR/Cas12aトランス切断によって検出しました。その結果、qPCRでは12個のサンプルが陽性であることが判明し、RPA/CRISPR/Cas12aでは16個のサンプルでL. passimが検出されました(図5A)。これは、RPAの反応性能が、DNA増幅法のゴールドスタンダードであるPCRよりも感度が高いことを示しています。
同様に、病原体モデルとしての L. passim DNAのCRISPR/Cas12a検出と組み合わせたqPCRおよびRPAの検出限界(LOD)を、66 ngから6 fgの範囲の L. passim DNAの段階希釈を使用して決定しました。qPCRはわずか6 pgを検出し、これは約96の寄生虫に相当します(図5B)。これに対し、RPAのLODは96の寄生虫に対応していました(図5C、D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig1.jpg"> 
図1:ミツバチにおけるHotSHOTアルカリ溶解法とRPA増幅法およびCas12検出法の組み合わせの一般的なワークフロー。 略語:RPA =リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;CRISPR = クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。Cas = CRISPR関連タンパク質。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig2.jpg"> 
図2:HotSHOTバッファーによる増幅可能な細胞溶解の処理。 (A)ミツバチの腹部をメスで切り、遠心チューブに入れます。(B)乳棒で、400μLのHotShotで浸軟を行います。(C)サーモブロック上で95°Cで10分間インキュベートします。(D)400 μLの40 mM Tris-HClで中和します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig3.jpg"> 
図3:Cas12a酵素およびFAM標識およびビオチン標識レポータープローブ溶液の調製に関する一般的なワークフロー。 略語:DEPC-水=ジエチルピロカーボネート処理水;crRNA = RNAクリスプr;Cas12 = CRISPR関連タンパク質の一種。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig4.jpg"> 
図4:FAMプローブとビオチンプローブを用いたCRISPR/Cas12a法による Lotmaria passim および Nosema ceranae .の検出。 FAM検出のために、(A)サンプルはサーモサイクラーでインキュベートされています。(B) L.passim および N.ceranaeの相対蛍光単位(RFU)。(C)フォトドキュメンテーションシステムによる同一サンプルの可視化。ビオチン試験では、(a)サーモブロックでインキュベートするサンプル。(b)サンプルをキットのイムノストリップに添加した (材料表を参照)。(c)インキュベーション後の結果。略語:LP = Lotmaria passim;NC= ノセマセラナエ;NTC= テンプレートコントロールなし。RFU:相対蛍光単位 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig5.jpg"> 
図5:qPCRとRPAの比較、および Lotmaria passimの検出限界。 (A)従来のqPCRおよびRPAを用いたミツバチサンプル中の L. passim の検出。(B)SsoFast EvaGreenを使用した L.passim のqPCR検出限界。(C)CRISPR/Cas12aとFAM標識プローブを用いた L. passim の検出限界。(D)ゲルイメージングシステム下での同じCRISPR/Cas12a検出( Cから)の視覚化、およびビオチン標識プローブ(下段)でCRISPR/Cas12aを使用した対応するラテラルフロー結果(下段)。略語:RPA =リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;qPCR=定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 反応バッファー</td>
			<td>1倍</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>25μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP(10 mM)</td>
			<td>1.8 mM</td>
			<td>1.8μL</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x ベーシックE-ミックス</td>
			<td>1倍</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>フォワードプライマー(10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0.5μL</td>
			<td>2.4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>リバースプライマー(10μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0.5μL</td>
			<td>2.4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x コアリアクションミックス</td>
			<td>1倍</td>
			<td>0.5μL</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC ウォーター</td>
			<td>--</td>
			<td>0.7μL</td>
			<td>3.7 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:最終容量が10 μLおよび50 μLのRPA用マスターミックスコンポーネント、および対応する使用濃度:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>10 μL反応</td>
			<td>50 μL反応</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>280 mM MgOAc</td>
			<td>1.8 mM</td>
			<td>0.5μL</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>デオキシリボ核酸</td>
			<td>10-0.1 ng</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2:RPAの反応でサンプルごとに添加する試薬の量
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>試薬</td>
			<td>【在庫】</td>
			<td>【最終版】</td>
			<td>1倍(μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas12a酵素</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNAの</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAMプローブ</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBバッファー10倍</td>
			<td>10倍</td>
			<td>1倍</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPAアンプリコン</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>32.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>トータル</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3:CRISPR/Cas 12a法によるFAM検出の混合物を作るための試薬の濃度。 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>試薬</td>
			<td>【在庫】</td>
			<td>【最終版】</td>
			<td>1倍(μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas12a酵素</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNAの</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ビオチンプローブ</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>500 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBバッファー10倍</td>
			<td>10倍</td>
			<td>1倍</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPAアンプリコン</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>トータル</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4:CRISPR/Cas 12a法によるビオチン検出の混合物を作るための試薬の濃度。

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