3 つの異なる方法論の比較分析を使用したがん細胞の増殖に対する SASP 因子の影響の評価

高齢がん細胞は、隣接する細胞に影響を与えるこれらの因子を分泌します。我々は、SASP駆動のパラクリンおよびジュクタクリンのHeLa細胞増殖への効果を調査する3つのin vitroモデルを提示し、リアルタイムインピーダンスモニタリングとライブセルイメージングにより動的、動態的、形態学的解析が可能となり、従来のエンドポイントアッセイを超えた老化および微小環境パラクリン効果を明らかにします。まず、細胞シーディング前にリアルタイム細胞解析システムを起動してください。

RTCAソフトウェアバージョン2.0を起動してください。Xノートボタンをクリックして実験の詳細を入力してください。スケジュールボタンをクリックし、背景記録と細胞増殖を72時間ごとに15分ごとに監視する2ステップを追加してください。

最初のステップを選んで「再生」をクリックします。電子プレートビューの各ウェルに50マイクロリットルの完全な培地を手動で追加します。次に、老化したHeLa細胞と非老化したHeLa細胞を、5ミリリットルの無菌で予温化されたPBSで洗浄します。

吸引後、予備温めた0.05%トリプシンを1ミリリットル追加し、インキュベーションします。抗生物質補充の完全なDMEMを5ミリリットルで中和します。その後、室温で500Gのセルを10分間遠心分離します。

上清液を捨てた後、細胞ペレットを抗生物質補充の完全なDMEMで5ミリリットル再懸浮させます。次に、抗生物質補充された完全なDMEMを100マイクロリットルのeプレートビューの各ウェルに非老化のHeLa細胞をシードします。eプレートビューをリアルタイムセル解析システムのクレードルに配置し、インキュベーター内でセルがプレート表面に付着できるようにします。

2番目のステップを選択し、インピーダンス測定を開始するために再生をクリックします。eプレート挿入孔内の種子細胞には、抗生物質補充された完全なDMEM60マイクロリットルを3つの異なる実験装置で使用しました。eプレート挿入物は、5%二酸化炭素を含んだインキュベーターで6時間、37度の温度で維持して取り付けます。

細胞シード6時間後に一時停止をクリックし、その後、eプレートビューの各ウェルから培養培地を優しく吸引して血清および非付着細胞を除去します。37度の摂氏で事前に温めたPBSで2回洗浄します。eプレートビューの各ウェルに140マイクロリットルの血清フリーDMEMを追加してください。

培地を取り除きます。eプレートインサートのウェルをPBSで洗浄し、その後60マイクロリットルの血清フリーDMEMを加えます。次に、eプレートインサートをeプレートビューに位置合わせます。

インサートが完全に井戸に種まくまで優しく押し下げます。結合されたプレートをリアルタイムセル解析システムに挿入します。再生をクリックすると、ソフトウェアを使って15分間隔でセルインデックス値をリアルタイムで監視を再開できます。

eプレートビューとeプレートインサートが結合されリアルタイムセル解析システムに挿入される時点で、セルインデックス値を正規化します。次に、データ分析ボタンを押して、リアルタイムセル解析システムから得られる最大細胞指数と傾斜データを用いて増殖率と数量を計算します。その後、適切な統計プログラムを使ってデータを分析します。

老化したHeLa細胞と非老化細胞を含む両方の6ウェルプレートから培養培地を吸引します。細胞を37度の予温PBSで2回洗浄し、残留血清や細胞の残渣を除去します。各ウェルに血清不使用抗生物質補助DMEM培地2ミリリットルを加え、細胞を37度の加湿インキュベーターで5%二酸化炭素で48時間培養します。

各ウェルから調整された媒体を層状安全キャビネット内の滅菌管に集めます。収集した調配培地を1000gで4度Cで10分間遠心分離し、細胞の残骸を除去し、その後10,000gで4度Cで10分間遠心分離して清算された上清液を得ます。次に、2ミリリットルの超遠心フィルターユニットを用いて4度Cの温度で3000gで60分間遠心分離し、400マイクロリットルまで濃縮します。

得られた濃縮液を新鮮な血清フリー培地で希釈し、層状安全キャビン内の滅菌チューブ内で1倍、2倍、3倍の濃縮調整媒体を準備します。細胞が付着したら、eプレートビューの各ウェルから培養培地を優しく吸引し、血清および非接着細胞を除去しPBSで洗浄します。次に、37度摂氏で加熱された200マイクロリットルの調整された培地を各グループにピペットで移します。

eプレートビューをリアルタイムセル分析システムに挿入し、「再生」をクリックすると、15分間隔で48時間にわたりセルインデックス値のリアルタイム監視を再開できます。細胞を3つの実験装置のマイクロスライドに植え、37度の湿度で5%二酸化炭素を含んだ環境で培養します。8時間の付着後、37度の予温PBSで細胞を2回洗浄します。

各ウェルに血清不使用のDulbecco's Modified Eagle's Mediumを200マイクロリットル追加します。Tempコントローラー2002-2を起動し、37度に設定します。CO2コントローラー2000を起動し、二酸化炭素5%に設定します。

蛍光光源をつけろ。スライドをステージトップのインキュベーションチャンバーに置く。コンピューターでソフトウェアを起動してください。

20倍の目標を選びます。位相差チャネルと蛍光FITCチャネルを加えます。ステージコントローラーを使って、各場所の位置をマークします。

時間間隔を30分に、取得時間を48時間に設定してから取得を開始します。両方の時点で緑色蛍光タンパク質陽性細胞を数え、分析のために増加率を計算します。ドキソルビシン処理はHeLa細胞の細胞老化を有意に誘発しました。

SA-ベータ-ガル陽性細胞の定量検査では、ドキソルビシン処理群で対照群よりも有意に高い割合が示されました。最初のアプローチでは、非老化性HeLa細胞と共培養したHeLa細胞は、非老化性HeLa細胞と共培養した細胞に比べて増殖率と能力が有意に向上しました。老化したHeLa細胞由来の2倍および3倍濃度の調整培地は、非老化細胞からの調整培地と比較して非老化HeLa細胞の増殖率と容量を大幅に増加させました。

3つ目のアプローチでは、共培養48時間後、GFP陽性のHeLa細胞は、非老化共培養またはGFPのみ対照群と比較して、高齢のHeLa細胞と共培養した際の増殖が有意に大きく増加しました。