2層マイクロ流体デバイスを用いた組織恒常性の電気機械制御の解明

制御された電場を適用して、組織が電気的手がかりにどのように反応するかを研究し、電流または電場が細胞の接着、増殖、および押し出しをどのように調節し、組織の恒常性に影響を与えるかに焦点を当てます。生理学的に関連する電流の方向が組織の状態を決定することを発見しました。頂端から基底野は増殖表現型を誘導し、基底から頂端野は細胞の押し出しを促進し、細胞全体の密度の調節を可能にします。

定量的な生体電気研究は長い間重力を介した移動に焦点を当ててきましたが、組織の恒常性は依然としてアクセスできません。私たちのシステムは、生理学的カートンが組織の組織と維持をどのように制御しているかを直接調査できるようになりました。私たちのプロトコルは、マイクロ流体工学、組織の電気刺激、構造顕微鏡と力顕微鏡、およびライブイメージングを統合して、組織恒常性の電気機械的制御を研究します。

私たちの研究は、コアの電気機械結合ルールを明らかにしました。新しいツールを使用すると、ネイティブの生体電気パターンがどのように出現して組織を調節するか、また、これらの電気機械的手がかりを調整することで複雑な組織の挙動を制御できるかどうかを調査できるようになりました。まず、きれいな層を1つのポリジメチルシロキサン(PDMSモールド)を置き、清潔なプラスチック製のディッシュキャップの上に上向きに置き、500マイクロリットルの液体紫外線硬化型接着剤をモールドにゆっくりと加えます。

へらを使用して、すべての突出した構造を慎重に濡らし、湿潤プロセス中に形成された気泡を取り除きます。カバースリップをPDMS金型にそっと押し付け、ラボ用ワイパーを使用して余分な紫外線硬化型接着剤を取り除き、カバースリップの上面が清潔で平らな状態に保たれるようにします。波長363〜370ナノメートルの均一に照射された紫外線の下で構造を部分的に硬化させます。

75%エタノールを使用して跡を拭き取ります。次に、構造を平らな面にしっかりと保持し、硬化した層からPDMSモールドをゆっくりと剥がします。次に、2.5 mm より厚い平らな PDMS スラブの上に、きれいな層 2 つの PDMS 金型を下向きに置きます。

ピンセットを使用して金型の特徴を上から軽くたたきます。特徴の下のインターフェースを観察して、暗くなったり、光学的コントラストを確認したりして、適切な接触を確認します。次に、PDMS金型とスラブの間のスペースを、毛細管現象によって液体紫外線硬化型接着剤で埋めます。

前述のように、紫外線下で10秒間構造を部分的に硬化させます。柔らかいパッド入りのピンセットを使用して、複合紫外線硬化型接着剤層とPDMSモールドをPDMSスラブからそっと剥がします。必要に応じて、硬化した接着剤層の余分な端を鋭利なハサミで切り取ります。

次に、長方形のガラスカバースリップに取り付けられたレイヤー1を平らな面に置きます。PDMS金型に取り付けられたままのレイヤー2をレイヤー1に合わせ、フィーチャーの下に影が現れるまで両方のレイヤーをしっかりと押し付けます。整列した構造を紫外線下で10秒間硬化させ、層1と2を2層のマイクロ流体チップに結合し、接着したチップからPDMSモールドをそっと剥がします。

すぐに10マイクロリットルのポリアクリルアミドゲル前駆体溶液を、第2層のスリットの真上の組織領域の中央にピペットで移管します。直径10ミリメートルの丸いガラスカバースリップを液滴にそっと押し付けて、平らなゲルを形成します。ゲル溶液がスリットを通って層1に流れ込み、バリアピラーの列で停止するのを観察します。

組み立てたマイクロ流体チップを紫外線下で5分間すぐに硬化させます。次に、チップを約1時間放置して、ポリアクリルアミドゲルが完全に固化します。次に、マイクロ流体チップを0.1モルHEPESバッファー中でpH 7.4で少なくとも1時間インキュベートして、ゲルを水和させ、ゲルとカバースリップの間の接着を減らします。

次に、鋭利なピンセットを使用して、ゲル表面からカバーのスリップをそっと取り除きます。医療グレードのポリカーボネートカートリッジを底面を上にして平らな面に置き、乾燥したチップを下向きにカートリッジに合わせます。チップとカートリッジの間の隙間にUV硬化型接着剤をピペットで入れ、毛細管現象で充填し、UV光で硬化させます。

製造されたマイクロ流体デバイスをバイオセーフティキャビネット内の200〜280ナノメートルの紫外線下に置いて滅菌します。氷上の1X DPBSで1ミリリットルコラーゲン1つの作業溶液あたり50マイクログラムの必要な量を調製します。氷上で、摂氏4度で保存されたpH 7.4の80マイクロリットルの冷たい0.1モルHEPES緩衝液で、無水ジメチルスルホキシドに溶解した2マイクロリットルのスルホ-SANPAH原液を希釈することにより、スルホ-SANPAH作業溶液を調製します。

ポリアクリルアミドゲルの端を実験用ワイプで軽くたたき、デバイス内で乾燥させます。80マイクロリットルのSulfo-SANPAH作業溶液をゲル表面にピペットでかけ、完全に浸漬し、チップを紫外線下に5分間置いてSulfo-SANPAHを活性化します。pH 7.4の冷たい0.1モルHEPESバッファーでゲルを3回すすぎます。

80マイクロリットルのSS作業溶液をゲル上にピペッティングし、紫外線下で5分間照射することにより、Sulfo-SANPAH処理を繰り返します。今回は、冷たい1X DPBSでゲルを3回すすぎます。最後に、100マイクロリットルのコラーゲン1溶液をポリアクリルアミドゲルにピペットで入れ、完全に覆われるようにし、1時間放置します。

付着していないコラーゲンを1X DPBSで3回洗い流し、さらに使用するまでゲルを1X DPBSに浸したままにします。ネジを使用してデバイスをインサートに取り付けます。次に、最大4つのデバイスインサートアセンブリを顕微鏡ステージに取り付けるために設計されたホルダーに固定します。

2ミリリットルの培地を装置の各メインウェルに加え、廃棄物除去チャネルを通して1X DPBSを洗い流して交換します。次に、白金電極を 45 ミリリットルの培地の入ったチューブに挿入し、培地に完全に浸されていることを確認します。シリンジで培地をTygonチューブに通し、しっかりとクリップします。

媒体で満たされたチューブの一方の端を電極チャンバーに接続し、もう一方の端をデバイスに接続します。次に、トリプシン処理または細胞懸濁液調製の推奨事項に従って細胞懸濁液を調製し、10万個の細胞をメインウェルに播種します。電極チャンバーを側面にしてセットアップを顕微鏡に取り付け、ソースメーターを電極チャンバーに接続します。

同じチャネル抵抗を持つ3つのデバイスを使用します。1 つをコントロール グループとして割り当てます。2番目のデバイスに先端から基礎電流を、3番目のデバイスに基底から先端への電流を印加します。

電流クランプモードで電気信号を供給し、合計20マイクロアンペアの電流を供給します。落射蛍光顕微鏡による全組織イメージングには、20倍対物レンズをお選びください。最後に、赤色蛍光および明視野チャネルにはチャネル561を選択します。

長時間のイメージング中に1時間の時間間隔を1つ選択します。電気刺激を細胞に垂直に適用して経上皮電位を破壊し、さまざまな電流方向での組織挙動におけるその役割を研究しました。位相差イメージングでは、頂端から基底、またはATB電流により、適用後10分以内に細胞接合部が明るくなりましたが、対照および基底から頂端へのBTA条件では、コントラストが低く、頂端面が平らでした。

ATB電流は、頂端セル表面で外側の凸を生み出しました。ゲルの変形は電流の方向に強く依存していました。ATB電流はゲルを上方に引っ張り、BTA電流はゲルを下方に圧縮しました。

接合E-カドヘリン強度は、BTA電流下では増加しましたが、対照と比較してATB電流下では有意に減少しました。接合アクチン強度は、ATB電流下では減少しましたが、BTA電流下では対照と比較して有意に増加しませんでした。ATB電流は単層を横切る多細胞生細胞の押し出しを引き起こしましたが、BTA電流は対照と同様に単層構造を維持しました。

細胞分布の空間的不均一性は、ATB電流下では有意に高かったが、BTAおよび対照条件下では低く均一なままだった。細胞増殖率はATB刺激下で増加し、時間の経過とともに分裂率が高くなりました。対照的に、BTA電流はより多くの細胞死イベントを誘発しました。