アルシアンブルー染色時のゼブラフィッシュ頭蓋顔面組織の解剖

ゼブラフィッシュの口蓋が経時的に成長するメカニズムを固定サンプルと、ライトシート顕微鏡を用いた高い空間分解能の胚のタイムラプスイメージングを用いて探求しています。私たちのプロトコルはシンプルで従いやすいです。生後5日のゼブラフィッシュの幼虫の頭蓋顔面軟骨を解剖し、分離するための詳細な手順が記載されています。

このプロトコルにより、組織および細胞スケールでの口蓋形状の慎重な特性評価が可能になり、最終的には口蓋の形態形成に対する解説抗原の影響を評価できるようになりました。まず、麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼虫を20〜25匹入手し、幼虫が動きを止めたら麻酔薬を取り除きます。1.5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドをチューブに加え、室温で毎分60回転に設定されたロッカーにサンプルを2時間置きます。

ピペットを使用して、チューブからできるだけ多くの固定剤を取り除きます。次に、1.5 ミリリットルの 50% エタノールをサンプルに加え、毎分 60 回転に設定された室温のロッカーに 10 分間置きます。次に、ピペットを使用して、チューブからエタノールを吸引し、1.5ミリリットルのアルシアンブルー染色液をサンプルに加えます。

幼虫を染色液中で室温で18〜20時間インキュベートし、毎分60回転で揺らします。次に、ピペットを使用して染色液を取り除き、室温のロッカーで1.5ミリリットルの蒸留水で1〜2分間幼虫を洗浄します。次に、1ミリリットルの漂白剤溶液をサンプルに加え、チューブを覆わずに室温で20分間インキュベートします。

ピペットを使用して、サンプルから漂白剤溶液を取り出し、サンプルを組織透明化溶液1および2で処理します。溶液2を除去した後、サンプルに1.5〜2ミリリットルの保存溶液を加えます。グリセロール含有量により、染色されたサンプルが10分以内に徐々に底に沈むのを観察します。

染色された幼虫をアガロースでコーティングされたペトリ皿の側面に置きます。鉗子を使用して、幼虫の体から卵黄をそっとこすり落とします。卵黄を取り除いた後、解剖中の干渉を避けるために幼虫を新鮮なペトリ皿に移し、1対の鉗子を使用して幼虫を頭の後部近くに保持します。

別のペアで、周囲の頭蓋顔の構造を損傷することなく、慎重に目を取り除きます。幼虫を保持しながら、1対の鉗子で、神経頭蓋の背側の組織の中心に切開を行います。次に、脳と関連組織をつまんで引き抜きます。

次に、幼虫の頭を体の他の部分から分離します。結果として生じる頭部領域には、神経頭蓋骨と、前端と後端にまだ付着している内臓頭蓋骨が含まれる必要があります。神経頭蓋骨と内臓頭蓋骨の間の2つの接続点を鉗子で慎重に切断し、完全に分離します。

最後に、100%グリセロールを1〜2滴きれいなスライドガラスに置き、解剖した神経頭蓋または内臓頭蓋をスライドに移します。鉗子を使用して、気泡が閉じ込められないように組織の上にカバースリップをそっと置き、イメージング前にカバースリップをマニキュアで密封します。解剖された神経頭蓋骨は、篩骨板、小柱帯、心膜軟骨など、明確にラベル付けされた複数の構造を示し、詳細な構造分析を可能にしました。

内臓頭蓋には、メッケル軟骨と、口蓋四角形軟骨や脳底鰓軟骨などの追加要素が含まれていました。受精後5日のアルシアンブルー染色により、篩骨プレートを明確に視覚化することができました。篩骨プレートの幅と長さは、画像解析を使用して一貫して測定可能であり、長さは幅よりも有意に大きく、15サンプルからのデータを定量化しました。

画像データから篩骨板領域を抽出し、明確な境界マーキングによる定量化によって確認しました。篩骨板では、内側領域に直方体細胞があり、外側部分にコルマー細胞がある明確な細胞配置が観察されました。ダッピー染色により、篩骨プレート内の個々の細胞核を視覚化することができました。