CRISPR-Cas9ベースの線虫 Steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持

私たちは農業応用のある線虫の共生の遺伝学に取り組んでいます。ゼノルハブダス菌の遺伝学的手法は非常に発達していますが、EPN遺伝学は依然として限られており、主にRNAiやEMSスクリーニングに依存しています。まずは、Xenorhabdus griffiniaeとComamonas aquaticusをまいた線虫寒天プレートを入手してください。

Xenorhabdus griffiniaeを含む準備済みのNGMプレートにSteinernema hermaphroditum nematodesをピックします。最適な成長のために25〜28度で孵化してください。マイクロインジェンダーの前夜、J3段階の両性具有をXenorhabdus griffiniaeをシードした新鮮なNGM寒天プレートに採取します。

マイクロインジェンダー当日には、若齢の両性具有者を選んで注射してください。BlastPを用いてSteinernema hermaphroditum参照ゲノムから標的遺伝子配列を抽出します。初期のコーディングエクソン、できれば最初のエクソンを選択し、デフォルト設定でCRISPRscanにシーケンスを入力して候補CRISPR RNAを生成します。

トップ候補CRISPR RNAをSteinernema hermaphroditumゲノムに照射し、オフターゲットマッチがないことを確認します。選ばれたCRISPR RNAおよびユニバーサルトランス活性化CRISPR RNAを、それぞれ100マイクロモルでマイナス80度の二重バッファーに保存します。電子レンジで2%アガロースを水で溶かします。

溶かしたアガロース50マイクロリットルをカバーグラスに移します。すぐにもう一つの蓋をかぶせてください。20分乾燥後、上蓋のガラスを外し、アガロースパッドの前面にラベルを貼ります。

アガロースパッドは数ヶ月から数年、室温で長期保存してください。注射用の針を準備するには、レーザーフィラメントプラーで石英毛細血管を引き抜き、針をピペットの保管箱に保管します。選択されたcrRNAとユニバーサルトランス活性化CRISPR RNAを1対1の比率で混合して、新鮮なガイドRNA二重合成を準備します。

チューブを94度で2分間培養し、その後室温まで冷却して二重焼きをなぎます。Cas9、塩化カリウム、gRNA二重合成を組み合わせて注射ミックスを組み立て、培養します。PCRチューブを3回ひらじって混ぜ、その後ミニ遠心分離機で10〜15秒間短く回転させます。

最終ミキシング後、最大1分間回転して内容物を集めます。次に、マイクロローダーの先端を使って1〜2マイクロリットルの注射ミックスを針に注入します。針をホルダーに取り付け、ハロカーボンオイルの下で両面テープを引っ張って先端を割ります。

マイクロインジェクターのクリーン機能を使って開口部の大きさをテストします。2%アガロースパッドに小さなハロカーボンオイルの滴を置きます。解剖顕微鏡と柔らかいプラチナワイヤーを使って、若い成体の両性具有者を拾い上げます。

細菌を除去するためにM9バッファーで洗ってください。線虫をアガロースパッドに移し、ハロカーボン油の滴に浸します。柔らかいプラチナワイヤーで線虫を優しくブラッシングし、動けなくなるまで撫でます。

パッドをマイクロインジェクションステージに取り付けてください。片方の生殖腺腕を見つけて、針で貫通します。インジェクターのクリーン機能を使って、性腺の流れが見えるまで99ポンド毎平方インチの注入ミックスを投与し、試薬がシンシチウムに到達することを確認します。

可能であれば、ステージを再配置し、同様に第2の性腺腕を注射します。注射直後、アガロースパッドに1〜2マイクロリットルのM9バッファーで再懸浮します。細いプラチナワイヤーで注入されたミミズをパッドから取り出し、M9バッファーで油を洗い流し、Comamonas aquaticaをシードした回収NGMプレートに回収します。

回収プレートは25度の温度で一晩孵化します。翌日、Xenorhabdus griffiniaeをまきまくった個々のNGMプレートに注入したP0線虫を分離します。2つのCRISPR RNAは、既に発表されたPAM部位でunc-22のSteinernema hermaphroditum homologueを標的としました。

ニコチンにさらされた線虫のジャーク解析では、unc-22変異体と野生型線虫の間で明確な運動の違いが認められました。PCRによる痙攣子孫の遺伝子型解析により、Pam 3およびPam 5の両方の標的部位に複数の淡い帯が確認されました。シーケンスにより、標的となったunc-22部位での挿入および欠失イベントが確認されました。

私の研究室ではEPN遺伝学のポスドク研究が拡大しました。CRISPRは現在、3種のSteinernemaで利用可能です。このプロトコルでは、CRISPR-Cas9遺伝子編集を用いて安定した遺伝性変異体を効率的に作製する技術を確立しました。

安定したCRISPR-Cas9遺伝子編集により、Steinernema-Xenorhabdus共生の分子メカニズムを解明できます。