Name: CRISPR-Cas9ベースの線虫 Steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぼう、CRISPR-Cas9を用いたSteinernema hermaphroditumのゲノム編集と変異系統維持法。昆虫病原線虫の遺伝学的メカニズム解明と害虫防除への応用可能性を探る。

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<ol><li>Stock, S., Blair, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Murfin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode-bacterium+symbioses--cooperation+and+conflict+revealed+in+the+%26%2334%3Bomics%26%2334%3B+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bull%22%5BJournal%5D)">Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the &#34;omics&#34; age.</a> Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).</li>
<li>Dillman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+nematode+by+any+other+name%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic nematode by any other name.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), iyab170(2022).</li>
<li>Sergeant, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+typing%2C+and+insecticidal+activity+of+Xenorhabdus+isolates+from+entomopathogenic+nematodes+in+United+Kingdom+soil+and+characterization+of+the+xpt+toxin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).</li>
<li>Walsh, K. T., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+microbial+populations+in+Steinernema+%28Steinernematidae%2C+Nematoda%29+infected+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae.</a> J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+The+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).</li>
<li>Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nematode+age+and+culture+conditions+on+morphological+and+physiological+parameters+in+the+bacterial+vesicle+of+Steinernema+carpocapsae+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae).</a> J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).</li>
<li>Cao, M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+Not%3A+Microbial+adaptive+responses+in+dynamic+symbiosis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments.</a> J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).</li>
<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).</li>
<li>Campos-Herrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+virulence+of+entomopathogenic+nematodes+against+the+pests+Frankliniella+occidentalis+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+and+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toolbox+for+Photorhabdus+and+Xenorhabdus%3A+pSEVA+based+heterologous+expression+systems+and+CRISPR%2FCpf1+based+genome+editing+for+rapid+natural+product+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling.</a> Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).</li>
<li>Ratnappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+knockdown+by+microinjection+in+the+model+entomopathogenic+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).</li>
<li>Cao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+genetically+manipulating+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes.</a> J Vis Exp. (181), e63885(2022).</li>
<li>Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterisation+of+Steinernema+hermaphroditum+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%2C+an+entomopathogenic+nematode+from+Indonesia%2C+and+its+phylogenetic+relationships+with+other+members+of+the+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus.</a> Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).</li>
<li>Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Steinernema+hermaphroditum+%28Nematoda%2C+Rhabditida%29%2C+from+West+Uttar+Pradesh%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India.</a> Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).</li>
<li>Schwarz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+and+its+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+stable+intercellular+bridges+formed+by+incomplete+cytokinesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development.</a> Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Sci Rep. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Culp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+nematode+Caenorhabditis+briggsae+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system.</a> Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).</li>
<li>Hellekes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+gene+editing+in+non-model+nematode+Panagrolaimus+sp.+PS1159%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159.</a> Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).</li>
<li>Patel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+stable+transgenic+lines+in+the+human-infective+nematode+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis.</a> G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+Designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genome+editing+strategy+to+generate+putative+null+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9.</a> G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+Edits+from+Sanger+Trace+Data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> J Vis Exp. (91), e52096(2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-CRISPR+strategy+for+efficient+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+A+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).</li>
<li>Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+A+new+tool+for+the+study+and+control+of+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites.</a> Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).</li>
<li>Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+parasitic+helminths%3A+A+brief+history+and+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).</li>
<li>Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+peroxidase+gene+controlling+body+size+in+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum.</a> Genetics. 226 (2), (2024).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アガー(80-100メッシュ)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP26411</td><td>LBピルビン酸板にも使用されます</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>16500500</td><td>また、遺伝子型分けにも利用されます</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 ヌクレアーゼ V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸塩針</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメント</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール&nbsp;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>エタノールに5 mg/mL</td></tr><tr><td>Comamonas aquatica (DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロースパッド用のカバーガラス</td><td>脳研究所</td><td>#4860-1D</td><td>48 x 60 mm No1 厚さ</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>ジメチルスルオキシド(DMSO)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>472301</td><td>0.5 M</td></tr><tr><td>DNAクリーン&コンセントレーター-5&nbsp;</td><td>ザイモリサーチ</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4xマイクロインジェクター(グリップヘッドセット付き、4サイズ0ニードルホルダー)</td><td>エッペンドルフ/カリブル</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>ガレリア・メロネラ 5齢幼虫</td><td>グラブコ</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>ゲルイメージングシステム</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディング染料</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン(2%)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>ジェルレッド</td><td>バイオティウム</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>ジェノタイピングプライマー:DNAオリゴ、25 nmol</td><td>IDT</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>ギブコ・バクト・ペプトーン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>ギブコ・バクト・トリプトン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>DF0123-17-3</td><td>また、ダークLB、LBピルビン酸プレートなどにも使用されています。</td></tr><tr><td>Gibco酵母抽出物</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>DF0127-17-9</td><td>また、ダークLB、LBピルビン酸プレートなどにも使用されています。</td></tr><tr><td>グリップヘッドセット 4サイズ1 ニードルホルダー</td><td>口径</td><td>EPE-5196083008</td><td>(ホウケイ酸塩針1B120F-4と組み合わせて)</td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル700</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>日々のメンテナンス用に硬いプラチナのワイヤーワームピック</td><td>トライテックリサーチ</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR編集の推論(ICE)</td><td>シンセゴ</td><td>該当なし</td><td>インデルを特定するためにサンガー配列を解析するソフトウェア</td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>レーザーニードルプラー P-2000</td><td>サター</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム(MgCl2)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム(MgSO4)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>M7506</td><td>M9バッファー用、NGMでも使用されます。</td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ 2x96ST</td><td>口径</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス・アクシオ・オブザーバーおよびアクキシオベルト200用のマイクロマニピュレーター取り付けアダプター</td><td>トライテックリサーチ</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>トライテック</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>ニコチン</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーデュプレックスバッファ</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq マスターミックス</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>ピペット保管箱</td><td>サター・インストゥルメンツ</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、二塩基(K2HPO4)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P3786</td><td>KOHはNGMの意味です</td></tr><tr><td>リン酸カリウム、単塩性(KH2PO4)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P5655</td><td>M9バッファー用、NGMでも使用されます。</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>石英針</td><td>サター・インストゥルメンツ</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>S. hermaphroditiumゲノム</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>IDT</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>M9、ダークLB、LBピルビン酸プレートにも使用されています</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性(Na2HPO4.7H20)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>S9390</td><td>M9バッファの場合</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P2256</td><td>また、LBピルビン酸プレートにも使用され、nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロインジェクション用のソフトプラチナワイヤーワームピック</td><td>シュアピュア・ケメタルズ</td><td>6824</td><td>プラチナ90%、イリジウム10%合金線、直径0.002インチ×長さ5フィート</td></tr><tr><td>標準ニードルホルダー</td><td>トライテックリサーチ</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Steinernema hermaphroditum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>立体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>インベタ3</td><td></td></tr><tr><td>トレハロース</td><td>コール・パーマー</td><td>EW-88195-99</td><td>0.08 M</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>AM9855G</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>トゥイーン20</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>垂直マイクロマニピュレーター取り付けアダプター</td><td>トライテックリサーチ</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9ベースの線虫 steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

CRISPR-Cas9ベースの線虫 Steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持

Entomopathogenic nematodes (EPNs) in the genus Steinernema and Heterorhabditis maintain mutualistic interactions with Xenorhabdus and Photorhabdus ...

私たちは農業応用のある線虫の共生の遺伝学に取り組んでいます。ゼノルハブダス菌の遺伝学的手法は非常に発達していますが、EPN遺伝学は依然として限られており、主にRNAiやEMSスクリーニングに依存しています。まずは、Xenorhabdus griffiniaeとComamonas aquaticusをまいた線虫寒天プレートを入手してください。Xenorhabdus griffiniaeを含む準備済みのNGMプレートにSteinernema hermaphroditum nematodesをピックします。最適な成長のために25〜28度で孵化してください。マイクロインジェンダーの前夜、J3段階の両性具有をXenorhabdus griffiniaeをシードした新鮮なNGM寒天プレートに採取します。マイクロインジェンダー当日には、若齢の両性具有者を選んで注射してください。BlastPを用いてSteinernema hermaphroditum参照ゲノムから標的遺伝子配列を抽出します。初期のコーディングエクソン、できれば最初のエクソンを選択し、デフォルト設定でCRISPRscanにシーケンスを入力して候補CRISPR RNAを生成します。トップ候補CRISPR RNAをSteinernema hermaphroditumゲノムに照射し、オフターゲットマッチがないことを確認します。選ばれたCRISPR RNAおよびユニバーサルトランス活性化CRISPR RNAを、それぞれ100マイクロモルでマイナス80度の二重バッファーに保存します。電子レンジで2%アガロースを水で溶かします。溶かしたアガロース50マイクロリットルをカバーグラスに移します。すぐにもう一つの蓋をかぶせてください。20分乾燥後、上蓋のガラスを外し、アガロースパッドの前面にラベルを貼ります。アガロースパッドは数ヶ月から数年、室温で長期保存してください。注射用の針を準備するには、レーザーフィラメントプラーで石英毛細血管を引き抜き、針をピペットの保管箱に保管します。選択されたcrRNAとユニバーサルトランス活性化CRISPR RNAを1対1の比率で混合して、新鮮なガイドRNA二重合成を準備します。チューブを94度で2分間培養し、その後室温まで冷却して二重焼きをなぎます。Cas9、塩化カリウム、gRNA二重合成を組み合わせて注射ミックスを組み立て、培養します。PCRチューブを3回ひらじって混ぜ、その後ミニ遠心分離機で10〜15秒間短く回転させます。最終ミキシング後、最大1分間回転して内容物を集めます。次に、マイクロローダーの先端を使って1〜2マイクロリットルの注射ミックスを針に注入します。針をホルダーに取り付け、ハロカーボンオイルの下で両面テープを引っ張って先端を割ります。マイクロインジェクターのクリーン機能を使って開口部の大きさをテストします。2%アガロースパッドに小さなハロカーボンオイルの滴を置きます。解剖顕微鏡と柔らかいプラチナワイヤーを使って、若い成体の両性具有者を拾い上げます。細菌を除去するためにM9バッファーで洗ってください。線虫をアガロースパッドに移し、ハロカーボン油の滴に浸します。柔らかいプラチナワイヤーで線虫を優しくブラッシングし、動けなくなるまで撫でます。パッドをマイクロインジェクションステージに取り付けてください。片方の生殖腺腕を見つけて、針で貫通します。インジェクターのクリーン機能を使って、性腺の流れが見えるまで99ポンド毎平方インチの注入ミックスを投与し、試薬がシンシチウムに到達することを確認します。可能であれば、ステージを再配置し、同様に第2の性腺腕を注射します。注射直後、アガロースパッドに1〜2マイクロリットルのM9バッファーで再懸浮します。細いプラチナワイヤーで注入されたミミズをパッドから取り出し、M9バッファーで油を洗い流し、Comamonas aquaticaをシードした回収NGMプレートに回収します。回収プレートは25度の温度で一晩孵化します。翌日、Xenorhabdus griffiniaeをまきまくった個々のNGMプレートに注入したP0線虫を分離します。2つのCRISPR RNAは、既に発表されたPAM部位でunc-22のSteinernema hermaphroditum homologueを標的としました。ニコチンにさらされた線虫のジャーク解析では、unc-22変異体と野生型線虫の間で明確な運動の違いが認められました。PCRによる痙攣子孫の遺伝子型解析により、Pam 3およびPam 5の両方の標的部位に複数の淡い帯が確認されました。シーケンスにより、標的となったunc-22部位での挿入および欠失イベントが確認されました。私の研究室ではEPN遺伝学のポスドク研究が拡大しました。CRISPRは現在、3種のSteinernemaで利用可能です。このプロトコルでは、CRISPR-Cas9遺伝子編集を用いて安定した遺伝性変異体を効率的に作製する技術を確立しました。安定したCRISPR-Cas9遺伝子編集により、Steinernema-Xenorhabdus共生の分子メカニズムを解明できます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

表現型欠陥の変異体のスクリーニングは、特定の生物学的プロセスで機能する遺伝子を同定するための簡単​​な方法です。この記事では、どのように文化の自由生活のワーム（例えば、への説明...

ワームの研究室の紹介：培養ワームから変異へ

ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア...

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CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

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キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

CRISPR/Cas9は、非モデル生物の遺伝子機能を特徴付けるためにますます使用されています。このプロトコルは、注射ミックスの調製から蚊の胚の取得と注入に、および必要な突然変異のために注入された蚊とその子孫を飼育、横断、およびスクリーニングする方法に 、Culex...

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CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

昆虫の真社会性の多くの特徴は、コロニー内のコミュニケーションと分業に依存しています。マイクロインジェクションとCRISPRを介した突然変異誘発によるアリ胚の主要な調節遺伝子の遺伝子操作は、真社会性昆虫の利他的行動の性質に関する洞察を提供します。...

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

このプロトコルの目的は、組み立てられたリボヌクレオタンパク質複合体とスクリーニングのためのdpy-10コクリスピーマーカーを使用して、C.エレガンスゲノムのシームレスなCRISPR /...

CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera...

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

この研究は、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼベースのホモ接合型ローカスト変異体の構築の体系的に最適化された手順と、イナゴ卵の凍結保存と蘇生のための詳細な方法を提供します。...

CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

昆虫病原性線虫は細菌と共生して生きており、一緒になって自然免疫系を損なうことによって昆虫に感染することに成功しています。線虫感染の遺伝的基盤に関する研究を促進するために、昆虫病原性線虫を維持し、遺伝的に操作する方法が記載されている。...

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

学ぼう、CRISPR-Cas9を用いたSteinernema hermaphroditumのゲノム編集と変異系統維持法。昆虫病原線虫の遺伝学的メカニズム解明と害虫防除への応用可能性を探る。

CRISPR-Cas9ベースの線虫 Steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持

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