高密度リポタンパク質特異的リン脂質流出アッセイ

冠動脈疾患リスクを評価するために、冠動脈プラーク脂質のHDL介在除去を測定する代理アッセイを開発しました。現在の課題は、研究および臨床応用の両方のために、簡単で迅速かつ堅牢なHDL脂質流入アッセイを開発することです。まず、必要な成分をすべて化学換気フードの下のグラスに入れ、脂質混合物を短時間ボルテックスして溶液を混ぜます。

混合物をガラス管の中で窒素の穏やかな流れの下で1時間乾燥させ、チューブの底に乾燥した脂質膜を形成します。ケイ酸カルシウム水和物をコーティングするには、乾燥脂質を含むガラス管に計量用の紙錐を挿入し、円錐を使って粉末を基底に導いて80ミリグラムのケイ酸カルシウム水和物粉末をチューブに入れます。すぐにチューブに生理食塩水2ミリリットルを加え、上部をパラフィルムで覆います。

手でガラス管を渦巻き、底の脂質の大部分を外します。ガラス管を発泡スチロールのプラットフォームに開けた穴に入れ、ボルテックスに接続し、強化テープでチューブをボルテックスプラットフォームに固定します。ガラス管を10分間渦巻かせて、チューブの壁に脂質が残っていないか確認してください。

ガラス管の内容物を1ミリリットルのピペットを使って15ミリリットルの円錐形プラスチック管に移します。ガラスチューブを3ミリリットルの生理食塩水で洗い、同じ15ミリリットルのチューブに移します。次に、脂質でコーティングされたケイ酸カルシウム水和物を含む15ミリリットルのプラスチックチューブを遠心分離機に入れ、935Gで4度Cで2分間回転させます。

細長いピペットの先端を使って上澄液を吸引します。上清液の上部から始め、吸引しながらピペットの先端をチューブの側面に沿ってゆっくり滑らせます。吸引時にはチューブを少し傾け、ペレットを乱さないように約200マイクロリットルの生理食塩水をペレットの上に残します。

次に生理食塩水を加え、総容量を5ミリリットルにします。遠心分離と上清液除去を4回繰り返します。最終洗浄後、生理食塩水を加えて総体積を2.5ミリリットルにします。サンプルセットに必要なウェル数に応じて、0.3ミリリットルの96ウェルプレートの各ウェルに75マイクロリットルの生理食塩水をピペットで注ぎます。

ボルテックスはLC-CSHを含む15ミリリットルのプラスチック製ストックチューブで、それぞれ10秒間3回投与します。単一のウェルピペットを使い、生理食塩水を含むウェルの右側に50マイクロリットルのLC-CSHを分散します。3本の井戸を回収した後、渦巻きプロトコルを繰り返して次の3本に注入します。

96ウェルプレートを180度回転させ、ウェルの左側が右に向くようにします。各ウェルの右側に25マイクロリットルの血漿または血清サンプルをピペットで採取します。陽性コントロールウェルには、基準値のヒト正常脂質血漿または血清を25マイクロリットル追加します。

次に、96ウェルプレートを接着膜でしっかりと密封し、37度摂氏、毎分1,200回転の温度で1時間、サーモミキサーで暗闇で培養します。孵化後、サーモミキサーからプレートを取り出し、氷の上に置きます。プレートを935G、4度Cで2分間遠心分離し、ドナー粒子をペレット状にして移動反応を止めます。

次に、LC-CSHペレットを乱さずに96ウェルプレートから接着膜を慎重に剥がしてください。反応板から50マイクロリットルの上清液を、マルチウェルピペットを用いて黒い96ウェルの平底ポリスチレン板のウェルに移します。貯水槽に生理食塩水を満たし、各井戸に50マイクロリットルの生理食塩水を加えます。

マルチウェルピペットを使用。125ミリリットルのプラスチック製エルレンマイヤーフラスコに1%のTriton X-100を準備します。準備済みの1%トリトンX-100を貯留槽に満たし、室温で同じ溶液を各井戸に100マイクロリットル加えます。

マルチウェルピペットで上下に優しくパイプを2〜3回送り、3ミリリットルのトランスファーピペットから空気で気泡を割って泡を割ります。最後に、励起波幅540ナノメートル、発光波幅600ナノメートルのフルオロメーターを用いてリサミン・ローダミン蛍光を測定します。LC-CSHを標識した連続希釈LRHPEを用いて標準曲線を作成し、非常に線形な蛍光応答を示しました。

血漿濃度曲線研究では、塩水対照群と並行して三重井戸で増加した蓄積されたヒト血漿が投与されました。血漿線量応答曲線は、PE、フラックス、血漿体積の間で優れた線形性を示し、15〜35マイクロリットルの範囲で強い相関を示しました。当院のシンプルで迅速なプロトコルは、心血管疾患リスクの発生を予測し、研究および臨床診断研究の両方に利用できます。

本研究結果は、本アッセイが心血管疾患における細胞および細胞外プラーク脂質の役割を明らかにできることを示しています。