3齢ショウジョウバエmelanogaster幼虫における嗅覚回路ニューロンの生体内および生体外カルシウムイメージング

このプロトコルは、GLUture 組織接着剤を使用して、生体内および生体外のカルシウム イメージングでの能力を強化します。これにより、研究者はショウジョウバエ幼虫の嗅覚回路ニューロンのカルシウム動態を理解することができます。シンプルさとコスト効率がこの技術の 2 つの主な利点であり、神経生理学的研究における実験の信頼性とアクセスしやすさが高まります。

6センチメートルのペトリ皿に小さな正方形のケムワイプを置き、2つの給餌室を準備します。飢えた状態の場合は、350マイクロリットルの蒸留水を追加します。飢餓していない状態では、350マイクロリットルの0.2モルスクロース溶液を加えます。

同数の洗浄された幼虫を各給餌室に移します。幼虫が室温で2時間、スクロース、飢餓していない、または蒸留水を食べさせます24 x 50ミリメートル、厚さ1.5ミリメートルの顕微鏡カバーガラスに、注射器から分配されたワセリンを使用して、井戸を作ります。GLUture局所組織接着剤をカバーガラスの中央に少量垂らします。

ガラス棒を使用して、GLUtureを薄く均一な層に均等に広げます。ブラシまたは細いワイヤーを使用して、1匹の幼虫を慎重にGLUtureに移します。幼虫の腹側を接着剤にそっと押し付けます。

GLUture を乾燥させて、幼虫が完全に固定されるようにします。幼虫が固定されたら、幼虫を100マイクロリットルのイメージングバッファーに浸します。カバーガラスをライカDMi8倒立顕微鏡に置き、横河電機のCSU-W1スピニングディスク共焦点スキャナーモジュールとカルシウムイメージング用のCCDカメラに接続します。

ステップ3.2〜3.3で説明したように、カルシウムイメージング用のGLUtureで顕微鏡カバーガラスを準備します。Ishimoto and Sano, 2018によって説明されているように解剖を完了します。P-10マイクロピペットを使用して、ペトリ皿から5マイクロリットルの解剖液で解剖された脳を注意深く吸引します。

ゆっくりと脳をGLUtureに排出します。GLUtureが乾く前に、2つの脳葉を下に向けて、背側腹索を上に向けて、脳を背側を上に向けます。P-200マイクロピペットを使用して、100マイクロリットルのカルシウムイメージングバッファーをカバーガラス上の固定化された幼虫の脳に移します。

ライカDMi8倒立回転顕微鏡を使用して、カルシウムイメージングのためにVisiViewを開きます。フィルター付きの10X/1.4 Any 対物レンズを使用して画像をキャプチャし、GFPレーザーとRFPレーザーを切り替えます。露出値は100〜1000ミリ秒の範囲で、ゲインは対応する露出値の50%に設定されます。

画像キャプチャ中は、2 の入札係数が適用されます。RFPレーザーでtdTomatoシグナルを検索して、目的のニューロンを特定します。関心領域が特定されたら、GFP レーザーに切り替えて GCaMP6f 信号をキャプチャします。

両方のチャネルのスタック画像をキャプチャする前に、tdTomato信号とGCaMP信号の両方が口語化されていることを確認してください。tdTomatoとGCaMP6fの成功信号の2つの別々の時系列記録を、毎秒0.5フレームの速度で同時に、合計2分間キャプチャします。tdTomatoとGCaMP6fの信号スタックをImageJにインポートします。

正しい関心領域を特定するには、tdTomato信号とGCaMP6f信号をマージして、共局在を確認します。検証後、tdTomatoチャネルとGCaMP6fチャネルを分割します。カスタムROIベースのマクロをImageJにインポートします。

GCaMP6fスタックを選択し、カルシウム分析のヒットランを実行します。マクロはまず最大強度投影を生成し、スタック登録プラグインを使用してモーション補正を実行し、ブリーチ補正を適用します。モーション補正は、各フレームの脳葉など、関心のある広い長方形の領域を定義することによって実行されました。

長方形のボックスは、すべてのフレームで局所的、空間的、ROIの形状を維持しながら、正確なモーション補正を保証するために、すべてのフレームのROI全体をカバーする必要があります。各ROIは、マクロが計算した1つ、すべてのフレームの強度、2つ、最初の10フレームの最大強度値と最小強度値の差などのベースライン変動の差、および3つ、フレーム間の最大強度変化、デルタF。10単位未満の強度変動を示すROIは排除されました。最終的なデータセットは、4つの列、1つは時間とフレーム、2つは飢餓または摂食されたサンプル条件、3つのレプリカID、個々のサンプル、および4つは正規化された強度に編成されました。

F ノルム値は 0 から 1 にスケーリングされます。最後に、カスタム R スクリプトを使用して、データ分析と視覚化を R で実行しました。解析を実行する前に、ggplot2、dplyr、readr などの必要なパッケージがインストールされ、更新されました。

出力には、時系列記録時の最初の 30 フレーム、60 フレーム、およびすべてのフレームの正規化されたカルシウム強度を示すヒート マップと、正規化された強度の中央値を示す箱ひげ図が含まれていました。正規化されたカルシウム強度の有意性は、マンホイットニーの U 検定を使用して評価されました。図1は、生体内および生外のカルシウムイメージングセットアップの概略図です。

幼虫サンプルA全体、または幼虫脳サンプルBを、青色に薄いGLUtureの層に固定し、ワセリンの井戸内に広げ、顕微鏡のカバーガラス上で丸くしました。サンプルを水色のカルシウムイメージングバッファーに浸し、倒立スピニングディスク共焦点顕微鏡でイメージングするために配置しました。サンプルのカルシウム蛍光画像の時系列がキャプチャされました。

回路図はBioRenderを使用して作成しました。図2は、GCaMP6f蛍光イメージングを示しています。A、488ナノメートルチャネル、GCaMP6fと緑、および525ナノメートルチャネルの蛍光を示す分割画像、赤のtdTomato。

結合された画像が右側のパネルに表示されます。B、キーストーンLNの緑色のGCaMP6fと赤色のtdTomatoの経時的な生の蛍光トレースの例。GCaMP6f蛍光の変動はカルシウム活性を示し、安定したtdTomatoシグナルはキーストーンLNを同定するためのコントロールとして使用されます。

C、in vivo トップパネルおよび ex-vivo ボトムパネル調製の代表的な GCaMP6f シグナル画像。左側に飢餓していないサンプルが表示され、右側に飢餓サンプルが表示されます。図3は、GCaMP6f蛍光測定を示しています。

A、左上のパネルは、生体内調製全幼虫における、飢餓していないN=5および飢餓した幼虫(N=5)のキーストーン要素からのカルシウムシグナルの平均時間的ダイナミクスを示すヒートマップを示しています。右上のパネルの箱ひげ図は、in-vivo調製の灰色で飢餓していないサンプルと白いサンプルで飢餓したサンプルの間で正規化されたカルシウムシグナル強度を比較しています。マンホイットニーのU検定、Pは0.001未満です。

B、左下のパネルは、ex-vivo調製解剖脳における非飢餓、N=5および窒餓N=5からのKeystone LNからのカルシウムシグナルの平均からポータルダイナミクスを示すヒートマップを示しています。右下のパネルの箱ひげ図は、ex vivo調製中の飢餓していない灰色のサンプルと飢餓した白色のサンプルの間で正規化されたカルシウムシグナル強度を比較しています。マンホイットニーのU検定Bは0.001未満です。

私たちの幼虫カルシウムイメージングアプローチを実証するために、ショウジョウバエ幼虫のin-vivoおよびex-vivo製剤の両方に適用することに成功しました。どちらの調製でも、飢餓していないサンプルと比較して、より高いキーストーンLN活性と飢餓サンプルが観察されました。これらのより高いキーストーン活性は、60 秒間の応答の時間的表現を示すヒート マップと、平均信号強度値を表す箱ひげ図で明確に観察されました。

これらの結果は、飢えた動物でより高い嗅覚ニューロン活動を示す最近の研究と一致しています。このビデオで示されているように、GLUture組織接着剤は、in-vivoとex-vivoの両方のセットアップでモーションアーティファクトを大幅に低減します。この方法は、臭気の外部適用や神経調節剤の内部過融合など、さまざまな種類の刺激の研究にも適用できます。