シングルセル質量分析メタボロミクス研究のためのサンプル前処理:細胞洗浄、急冷、乾燥、保管の組み合わせ

私たちは、単一細胞質量分析研究のために細胞代謝産物の完全性を維持するためのプロトコルを開発しました。洗浄、急冷、保管条件が細胞代謝産物にどのような影響を与えるかを調べました。細胞の不均一性と疾患メカニズムをよりよく理解するための単一細胞メタボロミクス研究を進めるために、新しいサンプル前処理方法と質量分析技術が最近開発されました。

研究者は、サンプル量の制限、サンプルの複雑さによる検出感度の低下、サンプルの前処理と分析による代謝物の変化など、複数の重要な課題を克服する必要があります。私たちは、単一細胞質量分析メタボローム研究のために、細胞代謝産物と細胞の完全性を維持できる包括的なサンプル前処理技術を実証します。私たちのプロトコルは、さまざまな質量分析技術を使用した単一細胞メタボロミクス研究用のサンプルの調製、保管、および輸送のための簡単で効果的な方法を提供する可能性があります。

まず、5%の二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで細胞を摂氏37度でインキュベートします。細胞のコンフルエントを毎日監視し、培養が80%コンフルエントに達したら継代します。継代のために、皿から培地を吸引し、5ミリリットルのPBSで一度すすいでください。

細胞の剥離を促進するために、細胞を摂氏37度で2ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAと3分間インキュベートします。8ミリリットルの予熱完全培地を加えてトリプシンを中和し、穏やかにピペットで細胞を分散させます。1ミリリットルの懸濁液を9ミリリットルの新鮮な完全培地に移し、細胞を計数します。

細胞を播種するには、10倍の最終濃度の10倍の6細胞の累乗に希釈します。個々の18ミリメートルのガラスカバースリップを12ウェルプレートのウェルに入れます。2ミリリットルの完全培地と200マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加え、ウェルあたり5細胞の2倍10乗を達成します。

細胞を一晩インキュベートして、付着させます。細胞を洗浄するには、2ミリリットルの冷たいギ酸アンモニウム溶液を12ウェルプレートの各ウェルに加えます。次に、滅菌鉗子を使用して、接着細胞を含む各カバースリップをウェルからそっと持ち上げ、2ミリリットルの冷たい0.9%ギ酸アンモニウム溶液をあらかじめ充填した別のウェルに2〜3秒間短時間置きます。

すすぎた各ギ酸アンモニウムを、細胞を上に向けて、アルミホイル容器内のシャーレに入れます。カバースリップの上に10〜20ミリリットルの液体窒素をゆっくりと注ぎ、完全に覆われるようにします。そしてすぐにピンセットでシャーレを傾けて、残っている液体窒素をデカントします。

極低温手袋と絶縁ピンセットを使用して、液体窒素チルカバースリップが入ったシャーレを真空濃縮器チャンバーに入れます。目に見える液体窒素が蒸発し、カバースリップが乾いているように見えるまで、標準の真空設定を使用してサンプルを5〜7分間処理します。乾燥したカバースリップに液体窒素や氷の結晶が残っていないことを確認してください。

次に、容器をペーパータオルで包み、摂氏80度の冷凍庫に48時間移します。保管後、シャーレの入ったカバースリップを室温の乾燥剤に10分間移します。カバースリップをデシケーターから取り除く前に、カバースリップに付着した結露した霜や水が完全に消えていることを確認してください。

サンプルを2つのグループに分けて適切に処理します。次に、単一のプローブをXYZステージに取り付け、デジタル顕微鏡の下に配置された電動XYZマニピュレーターに取り付けます。単一のプローブセットアップを質量分析計に結合して、SCMS分析を行います。

抽出溶媒として純度99.9%以上のギ酸0.1%を含むアセトンニトリルを使用し、シリンジポンプを使用して毎分150ナノリットルの流量で送達します。正イオンモードと負イオンモードの質量分析パラメータを設定します。次に、グループ1とグループ2の2つのカバースリップを、シングルプローブSCMSセットアップの電動XYZステージに一緒に置き、顕微鏡を使用して分析する細胞をランダムに選択します。

質量スペクトルを取得した後、同じ単一プローブ、溶媒流量、イオン化電圧を使用して、グループごとに約30個の細胞を分析します。カスタムRスクリプトを使用して生のSCMSデータを前処理し、バックグラウンドとノイズの除去を適用し、その後、イオン強度の正規化を総イオン電流に適用します。Python パッケージ MSD 同位体を使用して SCMS データを脱同位体化します。

社内のPythonスクリプトを使用してピークアライメントを実行します。ビニングには 0.01 マスター電荷比のビン幅を適用し、ピークアライメントには 0.01 マスター電荷比または 5 ppm の質量公差を適用します。Metabo Analyst 6.0を使用して統計データ分析を実施します。

T 検定を実行し、相対的な代謝産物レベルを示すヒート マップを生成します。上位100とT検定またはInovaを使用して、有意性でランク付けされた上位100の代謝物を生成し、有意な違いのあるこれらの上位100の代謝物を使用してヒートマップをプロットします。最後に、データベース検索のために10ppmの質量公差を使用して、ヒトメタボロームデータベースに対して正確なマスター電荷値を検索します。

正イオンモードでの主成分分析では、グループ1とグループ2が密接に重複していることが示され、代謝物プロファイルが非常に類似していることが示されました。マイナスイオンモードでは、同様のパターンが観察されましたが、グループ2はわずかに明確に見えました。上位100の代謝産物のヒートマップ分析では、両方のイオンモードで、グループ1とグループ2の間で非常に一貫した存在量パターンが示されました。

大きなシフトやグループ固有のクラスタリングは観察されません。いくつかの代謝物クラスターのわずかな変動は、イオン化効率または代謝物の安定性の違いを反映している可能性があります。