マウスにおける咳とくしゃみ反射の精密誘導と区別

このプロトコルはマウスの呼吸反射に焦点を当てています。気管と鼻腔を刺激して咳やくしゃみを誘発し、音声特徴に基づいてこれら2つのタイプのイベントを区別します。以前の研究では、ネブレーションされたカプサイシンやクエン酸をマウスの呼吸検査や咳・くしゃみ行動を刺激することがよくありました。

しかし、霧化による呼吸検査刺激が咳、くしゃみ、あるいはその両方を引き起こすのかは、現時点でこれら二つの反応を確実に区別する方法がないため、依然として明確ではありません。このプロジェクトでは、気管や鼻腔を選択的に刺激することで咳やくしゃみを誘発する方法を確立しました。また、咳とくしゃみの特徴を特定するために音響分析も用いました。

私たちの大規模な研究は、咳やくしゃみの将来の薬剤開発を直接支援する強力なツールを提供します。まず、28ゲージの針を約5ミリメートルの長さのカニューレに切り込みます。鉗子と研磨紙を使って両端を滑らかにし、片方の端をシリコンチューブに取り付けます。

チューブで接続されたカニューレを1ミリリットルの注射器に繋ぎ、水で洗浄して開通を確認します。次に、カニューレを2〜3腕の比率で90度に曲げます。長いアームを5センチのシリコンチューブに挿入します。

マウスをランダムに3つのグループに割り当て、それぞれ6匹ずつ割り当てます。麻酔されたマウスをテーブルの上で仰向けに固定します。頭蓋と頸部の毛を剃った後、ヨードホルとアルコールで消毒してください。

顕微鏡で頸部の皮膚を約1センチ切開し、組織や筋肉を鈍く切り離して気管を露出させます。32ゲージの針で輪状軟骨と気管軟骨の間の軟部組織を刺します。次に、眼科ハサミで最小限の気管開口部を作ります。

シリコン被覆の金属カニューレを気管腔内に約1ミリ挿入し、カニューレと気管の接合部を7-0縫合糸で固定します。次に、頭皮を約1センチ切開し、首から頭蓋骨まで皮下で鈍くトンネルを掘ります。シリコーンチューブを皮下トンネルを通して頭蓋骨に通し、デンタルセメントで頭蓋骨に固定し、その後皮膚を縫合します。

頸部切開部を縫合し、動物を5日間回復させます。超音波プローブにポート対応のシールリングを装着し、プローブを全身のプレチスモグラフィーチャンバーポートに挿入して気密接触を確保します。全身プレチスモグラフィーチャンバーをフローセンサーおよびバイアスフローシステムに接続します。

頭蓋骨固定型シリコーンチューブを30センチメートルの延長チューブに接続し、マウスを全身のプレチスモグラフィーチャンバーに入れます。チューブをチャンバーの上部ポートから伸ばし、チューブの周りにモデリングクレイでポートを密封します。気密性を確認するには、呼吸波形のピークが±2の±4以内に収まることを確認してください。

5ミリリットルのカプサイシン溶液を充填した1ミリリットルの注射器を延長チューブに接続し、マイクロインジェクションポンプに取り付けます。高速カメラをチャンバーに向けて設置してください。カメラの距離とピントを調整してクリアにし、サンプリングレートを160フレーム/秒に設定します。

同時に全身のプレチスモグラフィー、超音波、カメラのソフトウェアを使い始めます。ポンプを作動させてカプサイシンの注入を開始し、10分間咳のカウントを記録します。動物と処置に必要なすべての材料を準備してください。

麻酔と準備を終えた後、立体誘導フレームに固定します。手術部位をヨードフォルとアルコールで消毒してください。頭蓋骨と鼻骨の皮膚を切開し、メスで鼻骨を露出させます。

マイクロドリルを使い、鼻骨と鼻中隔軟骨の外側突起の接合部に0.5ミリメートルの穴を開けます。次に、バーホールから鼻粘膜を露出させます。32ゲージの針で鼻粘膜を優しく持ち上げ、鼻腔を露出させます。

次に、ポリエチレン管を立体走位アームに取り付けます。チューブの先端をバーホールの開口部とぴったり合わせ、デンタルセメントでチューブを鼻骨に固定し、皮膚を縫合します。マウスを温熱パッドの上に置き、意識が戻るまで回復させます。

全体プレキシスモグラフィーチャンバーを製造マニュアルに従ってフローセンサーおよびバイアスフローシステムに接続します。次に、超音波プローブにポートアダプターガスケットを取り付けます。プローブをプレシスモグラフィーチャンバーに挿入し、気密シールを確認します。

マウスをプレチスモグラフィーチャンバーに移し、ポリエチレン管を上部ポートから伸ばします。チューブを固定するためにモデリングクレイでポートを塞ぎます。チャンバーの気密性を確認し、先ほど示したようにカメラをセットアップしてください。

最後に、直径0.25ミリメートルのナイロンフィラメントを柔らかいチューブを通して鼻腔内に0ミリから3ミリメートルの深さまで押し込みます。フィラメントは手持ちの管の外側に5センチ露出させておきましょう。各刺激中、フィラメントの自由端を約45度まで曲げるまで押し、約0.6グラムの力を鼻粘膜に1秒間伝えます。

刺激を30秒ごとに繰り返し、くしゃみの反応を10分間記録します。機械的鼻刺激を伴う気管手術または鼻手術を受けたマウスとカプサイシン気管チャレンジを受けたマウスは、それぞれくしゃみと咳の出来事を有意に増加させました。全身のプレチスモグラフィー記録では、カプサイシン誘発咳および機械的誘発性くしゃみにおいて単一ピークおよびダブルピーク呼吸痕跡が認められました。

音声オシログラムでは、咳の音声は開始時に突然のピーク強度があり、0から30キロヘルツの範囲に集中していることが明らかになりました。一方、くしゃみの音声は徐々に強さが増し、0から80キロヘルツの範囲に及び、持続時間も長かったのです。シングルピーク咳の圧縮相は平均約32.39ミリ秒で、ダブルピーク咳よりもかなり短く約53.17ミリ秒でした。

シングルピークくしゃみの平均圧縮相は約44.03ミリ秒、ダブルピークのくしゃみは平均約74.24ミリ秒で、それよりかなり長くなっていました。単一ピークパターンは咳の77.55%で発生し、くしゃみでは32.42%のみが単一ピークを示し、ダブルピークパターンが67.58%で支配的でした。くしゃみの音声時間は咳持続時間より有意に長く、範囲は重複していました。鼻の感覚求心性の切断はカプサイシン誘発性くしゃみを有意に減少させ、咳は影響を受けませんでした。