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バイオテクノロジー局（DBT）、インド医学研究評議会（ICMR）、および科学工学研究委員会（SERB）からの支援に感謝いたします。

使用した試薬および器具は、以下の表に記載されています。 材料一覧表.
1. Mycobacteriumの培養
<ol>
	<li>0.2%グリセロール、0.05%Tween 80、および10% ADCを添加した10 mLのMiddlebrook 7H9培地に、MsmegまたはMtbのグリセロールストックから1 mLを接種し、 37 °C ODが1～1.5に達するまで、150 rpmで振盪しながら培養する。</li>
	<li>7H9培地10 mLに一次培養液を1%添加し、対数増殖期中期（OD値）まで二次培養を行う。600nm = 0.6–0.7.</li>
	<li>3 mLずつ分注し、培養液を2000 x gで遠心分離する。 g 室温（23～25 °C).</li>
	<li>ペレットを-で保存してください。80 °C RNA抽出まで。 
	注意：Mtb培養物については、適切なBSL3ガイドラインに従い、ペレットを95℃で20～25分間加熱不活化させてください。 
	注記： 図1 ホットフェノール法によるRNA抽出の基本手順を示すフローチャート。</li>
</ol>
<img alt="ホットフェノール法によるRNA抽出の図式；ワークフローには遠心分離、相分離、RNA完全性分析が示されている。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig1.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="図 1"> 
図 1: ホットフェノール法および分析の概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig1large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
2. RNA抽出
<ol>
	<li>ホットフェノール法（HP法）
	<ol>
		<li>追加 200 µL TESバッファー（100 mM Tris-HCl、pH 8.0；5 mM EDTA、pH 8.0；0.1 M NaCl；% SDS；1% β-メルカプトエタノール）を細胞ペレットに加え、ボルテックスミキサーで懸濁させる。</li>
		<li>サンプルに0.1 mmのシリカビーズを約0.1 g加える。ハンドヘルド式組織ホモジナイザーを用い、氷上でペレットが完全に解凍されるまで10〜15秒間処理する。この工程をさらに2サイクル繰り返し、各繰り返しの後、液体窒素で急冷する。</li>
		<li>または 室温にて、卓上高速ビーズホモジナイザー（Bead Ruptor）を用い、速度設定5（5.0 m/s）で1分間処理します。この工程を3サイクル繰り返し、各サイクルの後は、加熱を防ぐためサンプルを氷上で静置してください。 
		注：Mtb細胞の溶解を、ハンドヘルド式組織ホモジナイザーまたはビードラプターを用いて6〜8サイクル（1サイクルあたり1分）繰り返し、各サイクルの後に氷上で間欠的に冷却する。RNA抽出に必要なすべてのバッファーおよび試薬の調製には、DEPC（ジエチルピロカルボネート）処理水を使用すること。</li>
		<li>追加してください 200 µL TESバッファー（～まで予熱して） 65 °C)を各サンプルに加え、最終容量を〜まで調整する 400 µL各サンプルに、〜を添加する。 200 µL 酸性フェノール（100 mM クエン酸緩衝液、pH 4.5 で平衡化したフェノール）および 200 µL クロロホルム（試料に加える前に、酸性フェノールとクロロホルムを等量で混合すること）。</li>
		<li>サンプルを以下の条件でインキュベートします。 65 °C 振盪機能付きヒートブロックを用い、900 rpmで30分間処理した後、12,000 x gで遠心分離し g 室温で15分間静置します。遠心分離後、適切に相分離していることを確認してください（RNAを含む透明な上層の水相、明確なDNAの中間層、およびタンパク質と脂質を含む下層の有機相が観察されます）。</li>
		<li>上層の水相を取り除き、新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。再び同量の酸性フェノール：クロロホルムを加えます。12,000 x gで遠心分離します。 g 室温で15分間静置します。適切に相分離していることを確認してください。</li>
		<li>上層の水相を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、その後、以下を添加する。 30 µL 3 M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.3）、および 240 µL 冷却したイソプロパノールの。−でインキュベートする。80 °C 30分から1時間。 
		注：マイクロ遠心チューブは、-80℃で一晩保存可能です。80 °C このステップで、マイクロセントリフュージチューブが開かないようにパラフィルムで数層にわたって密封します。 65 °C インキュベーション中。 
		注意： フェノールおよびクロロホルムは有害化学物質であるため、適切な個人用保護具（PPE）を着用し、ドラフトチャンバーなどのエンジニアリングコントロールを導入し、特定の廃棄物処理手順に従わなければなりません。</li>
		<li>12,000 x gで遠心分離する g 室温で1時間静置する。ペレットが形成されていることを確認し、ペレットを乱さないように注意して上清を除去する。</li>
		<li>ペレットを1 mLの75%エタノールで再懸濁し、12,000 x gで遠心分離します。 g 室温で1分間行います。この工程を2回繰り返し、ペレットを風乾させます。</li>
		<li>ペレットを～に再懸濁させます。 50 µL ヌクレアーゼフリー水の。 
		注：RNAを溶解させるには、RNaseフリー水に浸し、室温で10～30分間インキュベートしてください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TRIzol法
	<ol>
		<li>追加 200 µL TRIzol試薬を細胞ペレットに加える。 
		注意： TRIzolは有害化学物質であるため、適切な個人用保護具（PPE）の着用、ドラフトチャンバーなどの工学的管理、および特定の廃棄物処理手順に従う必要があります。</li>
		<li>ステップ 2.1.2から2.1.3に従い、細胞溶解法を実施する。</li>
		<li>追加してください 200 µL TRIzol試薬を加え、続いて 200 µL クロロフォームを加え、1分間ボルテックスで撹拌する。13,400 x g 15分間、〜で 4 °C遠心分離後、適切に相分離していることを確認してください。</li>
		<li>水相を慎重に新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。</li>
		<li>～を加えてRNAを沈殿させる 500 µL イソプロパノールを水相に添加し、−でインキュベートする80 °C 30分から1時間。</li>
		<li>15,000 x gで遠心分離し、RNAをペレット化します。 g 20分間、～で 4 °Cペレットを注意深く観察し、ペレットを乱さないように上清を除去します。</li>
		<li>ペレットを1 mLの75%エタノールで再懸濁し、13,400 x gで遠心分離します。 g 1分間、〜で 4 °Cこの手順を2回繰り返し、ペレットを室温で30分間風乾させた後、以下に再懸濁する。 50 µL ヌクレアーゼフリー水の。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>市販のRNA抽出キット法
	<ol>
		<li>細胞ペレットを〜に再懸濁する 200 µL 再懸濁バッファー（キットに付属）の</li>
		<li>ステップ 2.1.2から2.1.3に記載されている細胞溶解法に従ってください。</li>
		<li>製造元の指示に従い、以降の実験を行ってください。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. DNase処理、定量および可視化
<ol>
	<li>ゲノムDNAの混入を除去するため、各RNAサンプルにDNase I (10units) を 1 µL、RDDバッファー (1x) を 5 µL 加え、室温で30分間インキュベートする。</li>
	<li>Nanodropを用いてRNAサンプルを分光光度計で定量し、Qubit4を用いてRNAの完全性を評価する。RINの許容値は7.5～10とする。また、A260/A280およびA260/A230の許容値は、それぞれ1.8～2.0および2.0～2.2の範囲とする。</li>
	<li>1X RNAローディングダイを用いて、1%アガロースゲルでRNAを可視化する。</li>
</ol>
4. cDNA合成および定量リアルタイムPCR
<ol>
	<li>cDNA逆転写キットと1 µg RNAを用い、メーカーの指示に従ってサーマルサイクラー内でcDNA調製のための20 µL反応系を構築する。</li>
	<li>メーカーの指示に従い、50 ngのcDNA、各0.4 µMのプライマー、およびSYBRを用いて10 µLのリアルタイムPCR反応系を構築する。リアルタイムPCR用サーマルサイクラーでサンプルを処理する。 
	注：qPCR解析には以下のプライマーを使用した： 
	Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3' 
	Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3' 
	Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3' 
	Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3' 
	Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3' 
	Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'</li>
</ol>
5. 統計解析
<ol>
	<li>Studentのt検定を実施する t検定 GraphPad Prismを用いて、すべての生物学的反復を用いて、 P p ≤ 0.05を統計的に有意であるとした。エラーバーは、3回以上の生物学的反復から得られた標準誤差を示す。</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report%2C+2024%22">Global tuberculosis report, 2024</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/b/74877">https://www.who.int/publications/b/74877</a> (2024).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-resistant+tuberculosis%3A+An+update+on+disease+burden%2C+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment.</a> Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).</li>
<li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+host-pathogen+cross-talk+by+transcriptional+profiling+of+both+Mycobacterium+tuberculosis+and+infected+human+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages.</a> PLoS One. 3 (1), e1403(2008).</li>
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<li>Rustad, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+stability+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).</li>
<li>Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+of+RNA+extraction+from+bacteria+refractory+to+disruption%2C+including+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria.</a> Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).</li>
<li>Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+efficient+method+for+the+isolation+of+DNA-free%2C+pure+and+intact+RNA+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis.</a> J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).</li>
<li>Hiebert, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+extraction+and+RNA-sequencing+method+for+transcriptomic+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis.</a> Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).</li>
<li>Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine-rich+peptides+potently+bind+ESAT6%2C+a+virulence+determinant+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+and+concurrently+affect+the+pathogen%27s+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth.</a> PLoS One. 4, e7615(2009).</li>
<li>Alli, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+RNA+extraction+in+Mycobacterium+tuberculosis+for+studying+intracellular+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Clin+Exp+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression.</a> Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).</li>
</ol>

著者間に利益相反はありません。すべての著者が本論文の投稿を承認しています。

Mycobacterium向けの簡便で堅牢なRNA抽出法を開発するため、ホットフェノール法を最適化した。続いて、抽出されたRNAを、広く用いられている2つの手法であるTRIzol法およびカラムベースのキット法12,13と比較した。これらの手法を、RNAの収量、純度、完全性、コスト、および処理時間の観点から比較し、下流の分子生物学的アプリケーションへの実用性を評価した。ホットフェノール法とTRIzol法は、キット法に比べて比較的時間がかかるものの、分解のない高品質なRNAを得ることができた。3つの手法すべてで同等の純度と完全性のRNAが得られたが、ホットフェノール法は一貫してより高いRNA収量を示した。さらに、ホットフェノール法とTRIzol法で抽出したRNAは、同様のCt値を示した。しかし、ホットフェノール法とRNeasy法の間では、Ct値に統計的に有意な差が認められた。実験には等量のRNAを使用したため、すべての手法で同様のCt値が得られることが予想されていた。RNeasy法で見られたこれらの差は、RNA抽出の化学的性質の違いに起因すると考えられる。ホットフェノール法とTRIzol法は有機溶媒ベースの手法であり、内在性膜タンパク質をコードする転写産物やGC含量の高い転写産物など、抽出が困難な転写産物の可溶化にしばより効果的である。対照的に、RNeasyはシリカカラムベースの手法であり、フェノールベースの手法と比較して、メンブレンに効率的に結合しない、あるいは洗浄工程で失われる特定の転写産物の回収率が低下する可能性がある（Figure 2）。重要な点として、細胞溶解にはハンドティッシュグラインダーとビードラプターのいずれを用いても同等のRNA収量が得られたため、細胞溶解の操作に柔軟性を持たせることが可能となった。さらに、本抽出法は少量の培養量で動作し、かつ冷温遠心分離を必要としないよう最適化された。この簡略化により、サンプル処理全体の容易さと効率性が向上している。
RNA抽出法の選択における重要な要素は、コスト、時間、および得られる品質のバランスを取ることである（Table 1）。Hot Phenol法は、多少時間はかかるものの、一般的な実験室用化学薬品を使用するため極めてコスト効率が高く、また、これまで発表された多くの手法で用いられてきた高性能なビーズ破砕装置を使用せずとも、3 mLという少ない培養量から高いRNA収量（3 mLの中対数増殖期培養液あたり、Msmeg RNA 60–70 µgおよびMtb RNA 35–45 µg）を得ることができる。このため、リソースの限られた環境で運用されている研究室にとって特に有利である。以前に発表されたhot phenolベースのRNA抽出法は、いくつかの重要な点において異なる。例えば、Manganらはhot phenol法を用いてM. bovisからRNAを抽出し、109個の細胞あたり約20 µgのRNA収量を報告している。しかし、培養量や抽出温度などの重要なパラメータが明確に指定されていなかった。さらに、彼らの手法では、機械的な細胞破砕の前に、入手が困難な試薬であるDivolab-1を用いた界面活性剤洗浄が含まれており、その後にクロロホルムとイソアミルアルコールによる抽出が行われている1。別のHot Phenol法では、Mtb細胞からRNAを抽出し、約39 µgの全RNAが得られており、これは本稿で述べる最適化された手法と同等である。しかし、この手法では比較的多い培養量（25 mL）が必要であり、処理時間が増加し、より大型の遠心分離機の使用が必要となる。さらに、抽出にはクロロホルム・イソアミルアルコール混合液が使用されており、抽出温度は報告されていない12,14。TRIzolも、適度なコストで良好なRNA収量と品質を得るために広く使用されているが15、収量は比較的低かった。RNeasyキットは利便性と速度に優れており、時間に制約のあるワークフローや経験の浅いユーザーに適しているが、他の2つの手法よりも大幅にコストが高く、収量は著しく低かった。要約すると、本稿で述べる手法は、マイコバクテリアの細胞溶解およびその後のRNA抽出において操作上の柔軟性を提供する。これにより、ユーザーはコストと収量か、あるいは処理時間かという優先順位に基づいて、3つの手法すべてで同等のRNA品質と完全性を維持しつつ、最も適切な方法を選択することが可能となる。

M. tuberculosis (Mtb)は結核 (TB) の原因菌であり、HIV/AIDSを上回り、単一の感染性病原体による死因として依然として最大の要因となっています。2024年、結核による死亡者は世界全体で約130万人に達しました1。この負担は、多剤耐性 (MDR) および広範囲薬剤耐性 (XDR) 株の有病率の上昇によってさらに深刻化しています。したがって、結核の病原性の分子基盤を理解し、新たな治療標的を特定することが急務となっています2。
Mtbの転写プロファイリングは、宿主と病原体の相互作用3、環境ストレスへの適応4、および薬剤耐性の根底にあるメカニズム5に関与する機能的要素を解明するための重要なツールとなっています。リアルタイムPCR、マイクロアレイ、RNAシーケンシング（RNA-seq）などの高度な手法により、マイコバクテリアのトランスクリプトームを分析する能力が大幅に向上しました6。しかし、これらの手法の成否は高品質なRNAの得られるかどうかに大きく依存しており、それは抽出時の効率的な細胞溶解にかかっています。Mtbの複雑なミコールイル-アラビノガラクタン-ペプチドグリカン細胞壁は、RNA抽出を特に困難にしています7。酵素加水分解8、超音波処理9、ビーズビーティング10を含む既存の溶解技術は、高価な装置や大量の培養液を必要とすることが多く、多くのBSL-3研究室における実用性を制限しています。さらに、Mtbの増殖速度が遅いため、十分なバイオマスを得るには長時間の培養が必要です11。
これらの制限を克服するために、迅速かつ経済的な、最適化されたホットフェノール法によるRNA抽出法が開発されました。対数増殖期中期の培養液をわずか3 mL使用するだけで、この方法により、下流のトランスクリプトーム解析に適した高品質なRNAが45–60 µg得られます。細胞溶解には、小型の手持ち式組織グラインダーと入手容易な試薬を使用するため、高価な装置は不要です。ホットフェノール法は以前に報告されていますが1,12、最適化されたこのホットフェノール法は、利便性、費用対効果、およびRNA収量を向上させています。最適化はM. smegmatis mc215 (Msmeg)を用いて行われ、Mtb H37Rvで正常に検証されました。

<table><tbody><tr><td>0.1 mm シリカビーズ</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP1691050</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>シグマ</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 4&amp;nbsp;</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>冷却遠心分離機</td><td>ThermoScientific</td><td>42541217</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>E02SS</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SRL</td><td>62889</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>MIULAB</td><td>MU-E02-1049</td><td></td></tr><tr><td>高効率 cDNA 逆転写キット&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>モーター駆動式組織ホモジナイザー G10</td><td>コロナ</td><td>G261608</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ</td><td>S586</td><td></td></tr><tr><td>Nanophotometer N50&amp;nbsp;</td><td>実装</td><td>T51601</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M クエン酸緩衝液（pH 4.5）で平衡化したフェノール</td><td>シグマ</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 フッ路計&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2.32262E+12</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRサーマルサイクラー</td><td>Analytik Jena AG</td><td>844-00503-2</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>安全データシート</td><td>シグマ</td><td>S988</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S289</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>621BR29739</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>シグマ</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Tris塩基</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;2-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td>516732</td><td></td></tr></tbody></table>

マイコバクテリアからの最適化ホットフェノール法によるrna抽出：信頼性の高い遺伝子発現解析のための堅牢なアプローチ

Optimized Hot Phenol&#8211;Based RNA Extraction from Mycobacteria: A Robust Approach for Reliable Gene Expression Analysis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb)は依然として世界的な健康脅威となっており、その生物学および薬剤耐性メカニズムを理解するための信頼性の高いトランスクリプトーム研究の必要性が強調されています。このような解析は、高品質かつ高収量のRNAを得ることに依存しています。いくつかのRNA抽出法が利用可能ですが、その多くは高価な試薬、大量の培養液、または特殊な装置を必要とするため、特にリソースが限られた環境における大規模な研究への適用には限界があります。本稿では、マイコバクテリウム属に特化して最適化されたホットフェノール法によるRNA抽出法を提示します。この手法は、最小限の培養量と一般的に入手可能な試薬を用いて、ハイスループットなトランスクリプトーム解析に適した高品質なRNAを安定して抽出します。RNAの量と完全性は、ゲル電気泳動およびRNA整合性解析 (RIN) によって評価し、ダウンストリームアプリケーションへの適合性をqPCRおよびQubit 4によって確認しました。最適化された手法の性能をベンチマークするため、同一の実験条件（同一のMycobacterium種、培養量、増殖相（対数増殖期および定常期）、および溶菌条件）の下で、TRIzolおよびRNeasyを用いた並行的なRNA抽出を実施しました。これにより、収量、品質、実現可能性、およびコストの直接的な比較が可能となりました。最適化されたホットフェノール法は、試薬コストと特殊装置への依存度を大幅に削減しつつ、同等またはそれ以上のRNA収量と品質を示しました。その効率性、再現性、および経済性により、本プロトコルはMtbおよびその他のマイコバクテリウム属における大規模な遺伝子発現およびトランスクリプトーム研究のための実用的な代替案を提供します。

RNAの品質および収量
RNAの品質および定量評価をアガロースゲル電気泳動により行った（Figure 2）。 すべての抽出方法において、23Sおよび16S rRNAに対応する明瞭でシャープなバンドが観察され、全RNAの分離が成功したことが確認された。Hot Phenol法およびTRIzol法では、23S（~2900 bp）、16S（~1500 bp）、および5S rRNA（~120 bp）を示す3本の明確なバンドが見られ、RNAが分解せず高品質であることが示された。対照的に、カラムベースのキット法では23Sと16Sのバンドのみが観察され、5S rRNAのバンドは消失しているか検出限界以下であった。これは、カラム精製中に低分子RNAが優先的に失われたためと考えられる。定量的に見ると、Hot Phenol法によるRNA収量は、TRIzol法およびRNeasy法に比べてそれぞれ1.5～2倍であった（Figure 2A,C）。平均収量はHot Phenol法で~60 µg、TRIzol法で~45 µg、RNeasy法で~30 µgであり、後者はHot Phenol法よりも収量が~50%低かった。収量に差はあるものの、RNAの完全性と純度はすべての手法で同等であった（Figure 2D,E）。
ライシス手法の効率を評価するため、ビードラプターを用いてRNAを抽出した。その結果、同等の収量、品質、および完全性が得られ、ビードラプターやビーターのような特殊な装置に頼らずとも、シンプルなハンドヘルド式組織グラインダーを用いることで効果的なライシスが可能であることが実証された（図2B、F–H）。
MtbはMsmegよりも溶解に対する耐性が高いため、Mtb H37Rv株を用いて最適化したHot Phenol法のさらなる検証を行いました。組織グラインダーとビードラプターの両方を用いた細胞溶解により、良好な収量、品質、および完全性を有するRNAが得られ（Figure 3A–D）、本手法の堅牢性が確認されました。ハンドヘルド組織グラインダーを用いたRNA抽出の収量（~35–45 µg/3 mL culture）は、ビードラプター（50–60 µg/3 mL）と比較して低かったものの、その差に統計的な有意性は認められず、また、大規模な遺伝子発現解析に十分な許容範囲内の量でした。すべてのRNA抽出は複数回繰り返し行われ、すべての独立した生物学的レプリケートを提示しています。ゲル画像に対してデンシトメトリー分析を行い、異なる手法間におけるRNA収量の統計的な差をさらに検証したところ、Hot Phenol法が最高の収量を示しました（Supplementary Figure 1A–D）。
RNAの純度と完全性
すべての方法で、A260/A280比が2.0付近という許容範囲内のRNAが得られ、タンパク質の混入が最小限であることが示されました（図2D）。RNAの完全性（RIN）はすべての方法で同等であり、値は7.5から10の範囲でした（図2D–H、付随 図2、下パネル）。これは、品質と完全性が良好であり、分解が最小限に抑えられていることを示しています。
RNA品質を確認するための定量PCR解析 
各手法で抽出したRNAが、後続の遺伝子発現解析に適しているか評価するため、qRT-PCRを実施した。Msmegのハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現について検討した。 mysA (MSMEG 2758)、および2つの転写調節因子、 sigE (MSMEG 5072)および sigH (MSMEG 1914)を用い、同量の入力RNAを使用して測定した。得られたCt（サイクルしきい値）値は、各サンプル中の完全で増幅可能なRNAの相対的な量を反映している。 (に示されるように図2I）、Hot PhenolおよびTRIzolを用いて抽出したRNAでは、約22〜25の範囲で同等のCt値が得られ、これはRNAの完全性がより高く、逆転写および増幅への適合性が高いことを反映していた。一方、キットを用いた方法ではCt値がわずかに高く（約27〜30）、検出可能な転写産物レベルがより低いことが示された。融解曲線分析により、〜の特異的な増幅が確認された。 mysA, sigE, および sigH 遺伝子、qPCRの特異性と効率を示す（補足図2（上パネル）。Mtb遺伝子を用いたqPCR解析においても、許容可能なCt値（約20～25）が示され、下流の遺伝子発現解析への適合性が確認された（図3E).
<img alt="RNA抽出法の比較；ゲル電気泳動（28S、18S、5S）および収量、Ct値、純度の棒グラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="図2"> 
図2～におけるRNA抽出法の比較 マイコバクテリウム. (AHot Phenol法、TRIzol法、およびRNeasy法を用いて抽出した全RNAのアガロースゲル電気泳動像。すべてのサンプルで明確な23Sおよび16S rRNAバンドが確認でき、RNAが分解せずに保持されていることを示している。B) ホットフェノール法を用いて抽出した全RNAのアガロースゲル電気泳動 ～経由で 異なる溶解方法、すなわちビーズルプターおよびハンドヘルド組織グラインダー。C) 全RNA回収量。Hot Phenolによる回収量が最も高く、次いでTRIzol、キット法であったことを示している。 (DRNAの純度はA260/A280比によって評価され、すべての手法において値は約2.0となり、タンパク質混入が最小限であることが示された。ERNA整合性番号（RIN）により、同等の整合性であることを示す。F–Hハンドヘルド式組織グラインダーおよびBead Ruptorを用いて溶解し、ホットフェノール法を用いて単離した試料間における、RNA収量、260/280比、およびRNA完全性の比較。I) ハウスキーピング遺伝子（例： mysA）および転写因子（sigE および sigH）。エラーバーは3つの生物学的反復（n = 3）の標準誤差を表しています。 PStudentのt検定を用いて算出されたp値 t検定. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig2largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大表示をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="MycobacteriumのRNA抽出比較、ゲル電気泳動、および収量と純度を分析する棒グラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig3.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="図3"> 
図3: ホットフェノール法を用いたMtbからのRNA単離。(A) Mtb H37Rv株から最適化されたホットフェノール法を用い、ビードルプタライザーおよびハンドヘルド組織グラインダーで抽出した全RNAを示すアガロースゲル電気泳動。(B–D) 単離したRNAの収量、260/280比、およびRNA完全性（RIN）推定値の比較。(E) sigA、16s rRNA、およびhsp70遺伝子を標的としたqRT-PCRからのCt値。誤差棒は3つの生物学的反復（n = 3）の標準誤差を示す。P値はStudentのt-testを用いて算出した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>加熱フェノール</td>
			<td>Trizol</td>
			<td>RNeasyキット</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>収量</td>
			<td>60 -70 μg</td>
			<td>35 -50 μg</td>
			<td>30 - 45 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>時間</td>
			<td>2.5〜3時間</td>
			<td>2〜2.5時間</td>
			<td>30～45分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反応あたりのコスト</td>
			<td>$0.10 – $0.20</td>
			<td>$1.500 – $2.00</td>
			<td>$7.00 – $10.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>限界点</td>
			<td> 時間がかかり、強力な変性剤（フェノール/SDS）を使用する</td>
			<td> 時間がかかる、Trizolなどの毒性の高い試薬の使用、冷却遠心機が必要、ホットフェノール法に比べて15倍高価である</td>
			<td>高コスト（ホットフェノール法より72倍高価）、収量低下、カラムの詰まり</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>利点</td>
			<td>少ない液量でより高い回収率を実現し、低コストであり、細胞溶解にビーズミル（ビートビーター）を使用せず、冷却遠心分離も不要です。</td>
			<td>中程度の収量および中程度のコスト、冷却遠心分離の必要性</td>
			<td>収量は中程度で、非常に高価である</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>主要なコスト要因</td>
			<td>一般的な研究室用試薬（TES緩衝液成分、酸性フェノール、クロロフォルム、イソプロパノール、エタノール）</td>
			<td>市販のTRI Reagent®、クロロホルムまたはクロロホルム：イソアミルアルコール、イソプロパノール、エタノール</td>
			<td>Qiagen社独自のスピンカラムおよびバッファー</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIN（RNA完全性数）</td>
			<td>8-10 RIN</td>
			<td>RIN 7.5-10</td>
			<td>9-10 RIN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 3種類の異なるRNA抽出法（ホットフェノール法、TRIzol法、RNeasy法）におけるコスト、時間、および制限事項の比較.
補足図1：RNA抽出の最適化。(A>) ハンドヘルド組織グラインダーを用いた溶解およびホットフェノールを用いたRNA抽出。(B>) TRIzolを用いたRNA抽出。(C>) RNeasy法を用いたRNA抽出。(D>) 異なる手法でMsmegから抽出したRNAのゲル画像のデンシトメトリー分析。エラーバーはGraphPad Prismを用いて算出した標準誤差を示す（n = 8）。(E>) Mtb株からのホットフェノールを用いたRNA抽出。すべてのゲル画像は独立した生物学的反復である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S1.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。</a>
補完図2：（上段）〜の融解曲線分析 mysA sigE および sigH M. smeg由来、n = 3；（下段）RNA完全性解析. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S2.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。</a>

本研究では、Mycobacterium属向けのホットフェノール法を用いたRNA抽出法を最適化し、トランスクリプトーム解析に適した高品質なRNAを回収しました。同一条件下でTRIzolおよびRNeasyと比較した結果、本手法はより高い回収率と同等の完全性を維持しつつ、コスト効率も向上しており、大規模な遺伝子発現研究における実用的な代替手法となることが示されました。

マイコバクテリアからの最適化ホットフェノール法によるRNA抽出：信頼性の高い遺伝子発現解析のための堅牢なアプローチ

結核菌（Mycobacterium tuberculosis; Mtb）は依然として世界的な主要な健康脅威となっており、その生物学を理解するための信頼性の高いトランスクリプトーム研究の必要性が強調されています。

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Amity University Uttar Pradesh.  This study optimizes a Hot Phenol–based RNA extraction method for Mycobacterium, yielding high-quality RNA suitable for transcriptomic analyses. When benchmarked against TRIzol and RNeasy under identical conditions, the method provided higher yield, comparable integrity, and improved cost-efficiency, offering a practical alternative for large-scale gene expression studies.

マイコバクテリアからの最適化ホットフェノール法によるRNA抽出：信頼性の高い遺伝子発現解析のための堅牢なアプローチ

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