Name: NgTET支援CRISPR-Casシステムによる正確なファージ変異誘発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶ、NgTET酵素を用いたファージDNA修飾の低減とCRISPR-Casによる傷のない変異誘発法。バイオテクノロジーとファージ治療への応用可能性を高める革新的な遺伝子工学技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+evolutionary+analysis+of+eukaryotic+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation.</a> Science. 328 (5980), 916-919 (2010).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Shitrit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+marine+cyanophages+reveals+integration+but+not+lysogeny+in+T7-like+cyanophages%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages.</a> ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).</li>
<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
<li>Adler, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+CRISPR-Cas13a+enables+efficient+phage+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing.</a> Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).</li>
<li>Pozhydaieva, N., Höfer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Golden+Gate+assembly+to+streamline+CRISPR-Cas%2FNgTET-based+phage+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis.</a> Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).</li>
<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
<li>Shi, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).</li>
<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

バクテリオファージは、細菌を特異的に標的とするウイルスです。これらは、バイオテクノロジーと医学、特に多剤耐性菌との闘いにおいて計り知れない可能性を秘めているため、大きな研究関心を集めています 1,2,3。それにもかかわらず、ファージ生物学は比較的研究が不十分です。細菌宿主を乗っ取る分子メカニズムをより深く理解することは、その治療およびバイオテクノロジーの可能性を最大限に活用するために不可欠です4。効率的なファージ感染の根底にある分子メカニズムを調査し、さらに特定の用途のためにファージを操作するには、ファージゲノムを遺伝子組み換えする能力が不可欠です。しかし、それはファージ生物学の分野で最も重要な課題の1つであり続けています3,5,6。
ファージDNAは、プリンおよびピリミジン塩基の特定の化学的変化、例えば、シトシングリコシル化およびメチル化によって修飾されることがよくあります。これらの修飾は、ファージ遺伝物質を宿主ヌクレアーゼによる認識および分解から保護します6。これらの修飾はファージの適応度にとって重要ですが、DNA標的システムに依存するファージゲノム工学アプローチにとって重大な障害となります2,3,7。
制限修飾システムやクラスター化規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)タンパク質ベースの技術を含む既存の突然変異誘発戦略は、シトシングリコシル化などの保護エピジェネティック修飾によりファージDNAを修飾する際に重大な課題に直面しています8。細菌細胞および真核細胞で非常に効果的なCRISPR-Cas媒介ゲノム編集は、Casヌクレアーゼによる標的ゲノム遺伝子座でのDNAの正確な切断と、その後の目的の変異を保有するドナーDNAとの相同組換えによるDNA修復の2つの重要なステップに依存しています1。しかし、ファージでは、DNA修飾により、Casヌクレアーゼがゲノムに効率的に結合または切断することが妨げられることがよくあります。さらに、ファージ複製の迅速かつ一過性の性質により、相同組換えの効率がさらに制限される可能性があります。これらの障壁により、ファージ変異誘発にDNAを標的とするCRISPR-Cas技術を適用することは特に困難です。ファージDNA修飾は、in vitroおよびin vivoの両方でCRISPR-CasによるファージDNAの標的化を損なうことが示されています6,7。
ファージにおける保護DNA修飾によってもたらされる課題に対処するために、10-11転座(TET)メチルシトシンジオキシゲナーゼ、特にNgTETの活性を利用するゲノム変異誘発戦略を導入します。真核生物では、TET酵素はメチル化シトシンの段階的な酸化を反復プロセスを通じて触媒します:メチルシトシン(5mdC)は最初にヒドロキシメチルシトシン(5hmdC)、次にホルミルシトシン(5fdC)、最後にカルボキシシトシン(5cadC)に変換されます(図1)。
ファージ変異誘発アプローチでは、NgTETを使用して保護DNA修飾の存在量を一時的に減少させ、それによってCas酵素9などのゲノム編集ツールへのファージDNAのアクセシビリティを高めます。NgTETは、異種細菌宿主、特に 大腸菌における活性可溶性形態での発現に成功したという以前の報告により、バクテリオファージゲノムの調節に選択されました。NgTETはファージ感染中も活性を維持しなければならないため、この特性は不可欠です10。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg"> 
図1:TETジオキシゲナーゼ1による5-メチルシトシンの段階的酸化。 TETジオキシゲナーゼは、5-メチル-2'-デオキシシチジン(5mdC)から5hmdC、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン(5fdC)、そして最終的には5-カルボキシル-2'-デオキシシチジン(5cadC)への連続酸化を触媒します。最終生成物である5cadCは、自発的または酵素的に未修飾のシトシン(dC)に戻り、それによって動的なエピジェネティックな調節に寄与します。この多段階プロセスは、真核生物における活性DNAメチル化の中心です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
メチルシトシンとヒドロキシメチルシトシンは、グリコシル化のようなかさばる保護構造を含むファージDNA過剰修飾の一般的な前駆体であるため、TETジオキシゲナーゼの酸化活性を利用して、これらのDNA過剰修飾の形成を防ぐことができます9。このTETベースのゲノム変異誘発アプローチでは、大腸菌でNgTETを組換えに異種的に発現させ、感染時にファージゲノム内のヒドロキシメチル化シトシンを酸化させることで、かさばるグリコシル化の形成を防ぎます。これらのかさばるDNA修飾の存在量を減らすことにより、私たちのアプローチは、CRISPR-CasヌクレアーゼへのファージDNAのアクセス可能性を高めることができます。このアクセシビリティの向上により、効率的な標的認識、正確なDNA切断、およびファージゲノムへの瘢痕のない点変異の導入が容易になり、遺伝子欠失、レポーター遺伝子挿入、またはPCRベースの変異体選択のための人工接合部の統合に依存する従来のファージ変異誘発法とは区別されます1,11.これらの従来の戦略は、これまでのところ、ファージゲノムにおける標的変異誘発に利用可能な唯一のツールであり、したがって、ここで紹介する方法の重要な基盤を表しています。ただし、単一のファージタンパク質は複数の機能を持つことができます。目的のタンパク質をコードする遺伝子全体が欠失すると、関連するすべての機能が破壊されます。対照的に、点突然変異を標的に導入することで、特定の機能を選択的に不活性化することができ、その役割の詳細な分析が可能になります。今日まで、多くのファージタンパク質の機能はほとんど特徴付けられていません。したがって、特定の遺伝子に関連する追加の活性を見落とす可能性があります。したがって、タンパク質全体に最小限の変化を引き起こしながら、単一の機能のみを除去することを目的とした最小限のアプローチが好ましい12,13。ここで説明する方法は、全体的なゲノム組織や機能を破壊することなく、正確な遺伝子改変を可能にします。以前のファージ変異誘発法のもう一つの大きな課題は、通常約0.1%の変異率をもたらす効率の低さでした1,11。この技術により、単一コドン変化を導入できる最初の突然変異誘発戦略を提示し、ターゲティング効率の顕著な7倍の向上を達成しました。ONTベースのハイスループットスクリーニング法と組み合わせることで、点変異の検出が簡素化され、1つの変異体を分離するために大規模なファージ集団をスクリーニングする必要がなくなります。ここで説明するTETベースの変異誘発戦略は、この分野での長年の制限に対処し、より信頼性の高いゲノム編集を可能にします14。
全体として、この方法はバクテリオファージ感染メカニズムの理解を深めるために適用されるだけでなく、合成生物学にも大きな期待を寄せています。正確かつ効率的なファージゲノムエンジニアリングを可能にすることで、ファージを特定の用途に合わせて調整する道が開かれ、それによってバイオテクノロジーおよび医療用途の可能性が高まります。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL反応チューブ</td><td>ザルシュテット</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mLカノシャルチューブ</td><td>ザルシュテット</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>15 mL オープントップ薄肉ポリプロピレンチューブ</td><td>ベックマン・コールター・ライフサイエンス</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm(超遠心分離用)</td></tr><tr><td>50 mL 標準チューブ</td><td>ザルシュテット</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x GCバッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>F519L</td><td></td></tr><tr><td>6x TriTrack DNAローディング色素&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>R1161</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>メリディアンバイオサイエンス</td><td>バイオ-41025</td><td>分子グレード</td></tr><tr><td>Avanti J-30I 遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター・ライフサイエンス</td><td>カタログなし&nbsp;数</td><td>セリエン-Nr.JKY14M01、https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>ホウ酸&nbsp;</td><td>メルク</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>NEB</td><td>R3733S</td><td></td></tr><tr><td>塩素カルシウムヘキサヒドラート</td><td>アクロスオーガニック</td><td>7774-34-7</td><td>97 %、超純粋&nbsp;</td></tr><tr><td>細胞密度計</td><td>ハーバードバイオクロム&nbsp;</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>ケミドックMP&nbsp;</td><td>バイオラッド</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWRの</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>キュヴェット</td><td>ザルシュテット</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>ネオフロックスGmbH</td><td>7558-79-4</td><td>医薬品グレード</td></tr><tr><td>使い捨てガラスパスツールピペット</td><td>VWRの</td><td>612-1702</td><td>230ミリメートル</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>4716728001</td><td>10 U/&micro;L</td></tr><tr><td>dNTPミックス(各10 mM dNTP)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>自社製品。</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>CRISPR-Cas12/ModA sgRNAを含むプラスミドコンストラクト</td></tr><tr><td>DS-spCas(CRISPR-Cas9システム)</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>48645 (addgene アクセサリ番号)</td><td>ファージ変異誘発のためのスペーサー含有CRISPR-Casプラスミド(CRISPR-Cas9システム)の構築のためのプラスミド(ステップ3.2)</td></tr><tr><td>大腸菌B株はT4感染に使用しました</td><td>DSMZの</td><td>カタログなし&nbsp;数</td><td>大腸菌 (Migula 1895)Castellani and Chalmers 1919 (DSM 613、ATCC 11303)</td></tr><tr><td>大腸菌BL21(DE3)発現株、コンピテント細胞</td><td>インビトロゲン</td><td>C600003</td><td>発現株、コンピテント細胞。</td></tr><tr><td>大腸菌DH5&α;クローニング株、コンピテント細胞</td><td>インビトロゲン</td><td>18265017</td><td>クローニング株、コンピテントセル。&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTAの</td><td>ロス</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(絶対)&nbsp;</td><td>VWRの</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Flongleフローセル</td><td>オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズ</td><td>カタログなし&nbsp;数</td><td>R10.4.1. 化学、https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>ジーンJETプラスミドミニプレップキット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNAラダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler ULR DNAラダー&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>SM1213</td><td></td></tr><tr><td>グラデーションマスター108</td><td>バイオコンプ</td><td>カタログなし&nbsp;数</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>ヘレウス Pico 17 遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>インフォーサー HT インキュベーター ミニトロン</td><td>インフォーズAG</td><td>カタログなし&nbsp;数</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>イソプロピル-&ベータ;-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>カール・ロス</td><td>T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-寒天</td><td>カール・ロス</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-ミディアム(ルリア/ミラー)&nbsp;</td><td>カール・ロス</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>MinIONデバイス&nbsp;</td><td>オックスフロッドナノポアテクノロジー</td><td>カタログなし&nbsp;数</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA E165A_fw</td><td>IDTの</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT</td><td>ModA E165Aの点変異の導入とゴールデンゲートクローニングの粘着性末端の導入のためのフォワードプライマー(ステップ3.1)</td></tr><tr><td>ModA E165A_rev</td><td>IDTの</td><td>カタタガタアガ TGACTATCCGGAAAC</td><td>ModA E165Aの点突然変異の導入とゴールデンゲートクローニングの粘着性末端の導入のためのリバースプライマー(ステップ3.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>IDTの</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG</td><td>ファージ変異誘発および対抗選択のためのCRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13システム用のスペーサーを生成するためのフォワードプライマー(ステップ3.2およびステップ4.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>IDTの</td><td>AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC</td><td>ファージ変異誘発および対抗選択のためのCRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13システム用のスペーサーを生成するためのリバースプライマー(ステップ3.2およびステップ4.1)</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 分光光度計&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>NucleoMagキット&nbsp;</td><td>マシェリー・ネーゲル</td><td>品番 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオシド消化ミックス&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560(CRISPR-Cas13システム)</td><td>アドジーン</td><td>186236 (addgene アクセサリ番号)</td><td>プラスミドをコードするCRISPR-Cas13システム(ステップ4.1)</td></tr><tr><td>pCpfl-spプラスミド(CRISPR-Cas12システム)</td><td>アドジーン</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>pCpfl-spプラスミド(CRISPR-Cas12システム)</td><td>アドジーン</td><td>122186 (addgene アクセサリ番号)</td><td>ファージ変異誘発のためのスペーサー含有CRISPR-Casプラスミド(CRISPR-Cas12システム)を構築するためのプラスミド(ステップ3.2)</td></tr><tr><td>PCR反応容器</td><td>ザルシュテット</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>ペクグリーン</td><td>VWRの</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>自社製品。</td><td>カタログなし&nbsp;数</td><td>プラスミドはリクエストに応じて入手でき、プラスミドマップは次の https://zenodo.org/records/10615143&nbsp にあります。</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>自社製品。</td><td>カタログなし&nbsp;数</td><td>ゴールデンゲートクローニング(ステップ3.1)によるpET28a_NgTET_donor DNAを構築するためのプラスミド、プラスミド&nbsp;リクエストに応じて入手でき、プラスミドマップは次の https://zenodo.org/records/10615143&nbsp にあります。</td></tr><tr><td>ペトリプレート</td><td>ザルシュテット</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm(カム付き)</td></tr><tr><td>Phusion DNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>F-530XL</td><td>2 U/&マイクロ;L</td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>7778-77-0</td><td>単塩基性</td></tr><tr><td>PowerPac ユニバーサル電源</td><td>バイオラッド</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK&nbsp;</td><td>カール・ロス&nbsp;</td><td>7528.1</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット&nbsp;</td><td>キアゲン</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Quantus 蛍光光度計、QuantiFluor dsDNA システム</td><td>プロメガ</td><td>E2670</td><td></td></tr><tr><td>RNase A / T1&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EN0551</td><td>2 mg/mL の RNase A 5000 U/mL の RNase T1&nbsp を混合します。</td></tr><tr><td>DNA抽出用Roti-Aqua P / C / I&nbsp;</td><td>カール・ロス</td><td>X985.1</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>SQK-LSK109ライゲーションシーケンシングキット</td><td>オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズ</td><td>カタログなし&nbsp;数</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>Steritopフィルター、0.22およびマイクロ;M 細孔サイズ</td><td>ミリポール</td><td>S2GPT05RE</td><td>250 mL および 500 mL</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン 50 mg/L</td><td>カール・ロス</td><td>HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>サクロース</td><td>ネオフロックスGmbH</td><td>57-50-1</td><td>分子生物学&nbsp;</td></tr><tr><td>スイングバケットアルミローター&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター・ライフサイエンス</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ 5 U/&ミクロ;L</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼバッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>B69</td><td></td></tr><tr><td>試験管、厚壁、リムレス</td><td>カール・ヘクトGmbH</td><td>42775054</td><td>100 mm x 18 mm</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー、T100</td><td>バイオラッド</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサーの快適さ&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>バス、VWB2&nbsp;</td><td>VWRの</td><td>462-0557</td><td>容量12L</td></tr></tbody></table>

ngtet支援crispr-casシステムによる正確なファージ変異誘発

Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

勾配におけるファージバンドの同定 グラジエントにおけるファージバンドの可視性は、グラジエントにロードされた最初のサンプル中のファージ濃度に依存します。ファージが十分に濃縮されている場合(~&gt;1 × 1011 PFU/mL)、下からグラデーションを光源で照らすことでバンドがはっきりと見えます( 図3を参照)。
ただし、ファージ濃度が低いと、バンドが簡単に見えない場合があります。この場合、ファージの検出を可能にする暗闇の中でチューブを下から照らして視覚化の試みを繰り返すことをお勧めします。
ファージバンドがまだ見えない場合は、鈍いカニューレを使用して上部から勾配画分を慎重に取り除き、画分あたり1.5 mLを収集します。これらの画分は、プラークアッセイを介して分析され、ファージ濃度を決定できます。ファージ濃度が最も高い2つの画分を組み合わせて、その後のDNA抽出を行う必要があります。
<p clas...

NgTET支援CRISPR-Casシステムによる正確なファージ変異誘発

Bacteriophages, viruses that specifically target their bacterial hosts, hold significant potential for biotechnology and medicine, especially in combating ...

precise-phage-mutagenesis-with-ngtet-assisted-crispr-cas-systems

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。...

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

体細胞株を遺伝子操作する能力の最近の進歩は、基礎研究および応用研究の大きな可能性を秘めている。ここでは、選択マーカーを使用した場合と使用しない場合の、哺乳類細胞株におけるCRISP / Cas9生成ノックアウト産生およびスクリーニングのための2つのアプローチを提示する。...

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

このプロトコルは哺乳類細胞における点突然変異の修復システムを編集 CRISPR/Cas9 ベースの遺伝子のワークフローについて説明します。ここで、ターゲット ・ サイトで塩基形成測定の詳細な後続実験的戦略と遺伝子編集へのコンビナトリアル...

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

組立 Cas9 を利用した複雑なリボ核タンパク質 (RNP)...

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア...

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR Cas は植物や動物の複雑なゲノムをエンジニア リングする強力な技術です。ここでは、我々 は異なる Ca 酵素を使用して人間のゲノムを効率的に編集するためのプロトコルを詳しく説明します。我々...

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

ここでは、ターゲット上の活動の損失することがなくより高い特定性を達成するために CRISPR Cas9 を最適化するためにプロトコルを提案する.狙撃スクリーンと呼ばれる進化のアプローチを使用して、所望の特性を持つ変異体 Cas9 を見つけます。スナイパー Cas9 は切り捨てられた単一ガイド Rna...

進化を介してターゲットの活性を失うことがなく CRISPR Cas9 のオフターゲット効果を最小限に抑えるための狙撃兵 Cas9 を使用してください。

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

このプロトコルの目的は、組み立てられたリボヌクレオタンパク質複合体とスクリーニングのためのdpy-10コクリスピーマーカーを使用して、C.エレガンスゲノムのシームレスなCRISPR /...

CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

この研究は、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼベースのホモ接合型ローカスト変異体の構築の体系的に最適化された手順と、イナゴ卵の凍結保存と蘇生のための詳細な方法を提供します。...

CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

CRISPRのような技術に対する大きな障壁は、重要な遺伝子を破壊する可能性のあるオフターゲットイベントです。「Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by...

オフターゲット遺伝子編集の検討のためのCIRCLE-Seq

学ぶ、NgTET酵素を用いたファージDNA修飾の低減とCRISPR-Casによる傷のない変異誘発法。バイオテクノロジーとファージ治療への応用可能性を高める革新的な遺伝子工学技術です。

NgTET支援CRISPR-Casシステムによる正確なファージ変異誘発

さらに動画を探す