NgTET支援CRISPR-Casシステムによる正確なファージ変異誘発

ファージ感染を分子レベルで研究しています。これは本当に基礎科学です。しかし、私たちは基礎科学を行うだけでなく、この基礎科学を応用し、この知識を使用してファージ感染を研究し、ファージ工学や治療用途に活用したいと考えています。

ファージ研究分野における最新の開発の 1 つは、細菌免疫系の発見です。この免疫システムはすべての細菌に存在し、ファージと実際に戦うためのツールを特定または生成します。しかし、ファージは非常に賢いです。

ファージはツールも識別し、それらの免疫システムから逃れることができるツールを開発することができました。そして、1つのツールは、実際にはそのDNAを改変することによって改変されます。そして、これは特に私たちにとって非常に興味深いことですが、ファージが免疫系から逃れるために生成したこれらのDNA修飾の化学的性質を研究することは非常に興味深いことであり、最終的にファージを操作するためのツールにもなることができます。

過去10年間で、世界中の優れた同僚によって素晴らしい技術が開発されました。これらのテクノロジーの1つは、たとえば次世代シーケンシングです。この技術に基づいて、ファージだけでなく、宿主ゲノム全体を分子レベルで配列決定することもできます。

一方、質量分析、プロテオミクスのようなものが開発されました。CRISPRは、現在、さまざまな生命の王国で適用されている素晴らしいツールです。また、私たちは現在、これをファージゲノムの操作に使用しています。

これらは、今日のファージに対する私たちの考え方を再構築した素晴らしいテクノロジーのほんの一部です。現在の課題について話すとき、私たちが目にする課題の1つは、ファージゲノムのエンジニアリングバイオCRISPRです。ファージゲノムはDNA修飾によって完全に改変されており、CRISPR核ACEは実際にはDNAを切断することができません。

したがって、これは、細菌ファージのゲノムを操作したい場合に克服する必要がある課題です。私のグループは、RNAのまったく新しい構成要素を発見しました。私たちは、特定の転写産物が5つの主要末端、いわゆる酸化還元スペクター、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドショートNADを運んでいることを発見し、これを最近、大腸菌T4ファージ相互作用で初めて発見しました。

この発見に基づいて、RNAとタンパク質がまったく新しい方法で相互作用できることも特定しました。先ほど説明したこのNADは、RNAとタンパク質を互いにリンクする分子接着剤のように機能していることを発見しました。このRNAの高揚感は、RNAとタンパク質が自然界でどのように相互作用するかを示すまったく新しい方法です。

そして、私たちはエコ抗ファージ相互作用においてこの発見をしました。また、この基礎科学を応用し、例えばRNAベースの治療分野に応用したいと考えています。まず、500マイクロリットルのファージ懸濁液を20単位のDNAで処理します1。

2マイクロリットルのRNA AT1をチューブに加えます。処理した混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、準備したスクロース勾配の上に500マイクロリットルの処理したファージ溶液をロードします。

70, 000 Gの勾配を摂氏4度で20分間遠心分離します。遠心分離チューブを下から照らして、勾配の濁ったファージバンドを視覚化します。次に、鈍いカニューレを使用して、ファージを含む画分を新しい超遠心分離チューブに慎重に取り出します。

次に、30ミリリットルの氷冷TMバッファーをチューブと遠心分離機に加えます。次に、上清を廃棄した後、ペレットを500マイクロリットルのTMバッファーに再懸濁します。再懸濁したファージをガラスバイアルに入れて摂氏4度で一晩保存します。

再懸濁したファージに1マイクログラムのプロテイナーゼKを加えます。混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、同量のフェノールクロロホルム、イソアミルアルコール混合物をサンプルに加えます。

よく混合するために反転し、遠心分離します。水相を新しい反応チューブに移し、抽出を3回繰り返します。等量のクロロホルムを使用してクロロホルムバック抽出を3回実行し、残留フェノールを除去します。

次に、PH 5.5で0.1体積の3モル酢酸ナトリウムと2.5体積のエタノールを加えてDNAを沈殿させます。混合物を摂氏マイナス20度で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを摂氏4度で1時間15, 000 Gで遠心分離し、DNAをペレット化します。

DNAペレットを200マイクロリットルの70%エタノールで2回洗浄します。チューブを軽く振って、もう一度遠心分離します。上清を慎重に取り除きます。

次に、精製したDNAを超純水に懸濁します。さらに使用するまで、DNAを摂氏マイナス20度で保存してください。PET 28 NGTetプラスミドとCAS 12またはCAS 9発現プラスミドの両方で形質転換された大腸菌BL 21D 3細胞を接種します。

適切な抗生物質を添加したLB培地で、振とうしながら摂氏37度で培養物を増殖させます。0.05ミリモルのIPTGを添加してNG TED発現を誘導し、摂氏37度でさらに2時間インキュベートします。対照として、NgTET過剰発現の有無にかかわらず大腸菌BL 21 D3株を比較します。

300マイクロリットルの大腸菌培養物を滅菌チューブに移します。T4野生型またはNgTET処理ファージのいずれかで培養物を感染の多重度0.01で感染させます。ファージの分布が均一になるように穏やかに混合し、再度インキュベートします。

バクテリアファージ混合物を、0.75%オーガーと抗生物質を含む4ミリリットルのLBソフトオーガーに加えます。気泡ができないように、十分に混ぜますが、穏やかに混ぜます。ソフトオーガー混合物を予熱されたLBオーガープレートに注ぎます。

プレートを室温で短時間固化させ、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、プラークを数えて、プラーク形成ユニットの数を決定します。カウンター選択のために、大腸菌に感染させ、カウンター選択するファージを使用して13スペーサーをキャストします。

変異誘発と同じ条件下でカウンタ選択を行います。インキュベーション後、SUPナタントを0.45マイクロメートルのフィルターでろ過し、細菌の破片を除去します。カウンター選択およびろ過されたファージを使用して、大腸菌B株のプラークアッセイを行い、下流の検証のために個々のプラークを単離します。

ファージバンドは、T4ファージサンプルが十分に濃縮されているときにはっきりと見えました。大腸菌におけるNgTETタンパク質の発現は、細胞溶解および遠心分離後の可溶性画分と不溶性画分の両方でその存在を示すSDSファージによって確認されました。クロマトグラムは、ジオキシデノシン、ジヨードヒドロキシキノリン、およびチミジンの相対存在量が、野生型とNgTET処理のT4ファージDNAの間で変化していないことを示しました。

修飾シトシン誘導体の存在量は、未処理のサンプルと比較して、NgTET処理されたファージDNAで有意に減少しました。NgTET遺伝子を含むプラスミドと、標的変異誘発のための相同性領域を、ゴールデンゲートクローニングを使用して構築しました。PCRスクリーニングにより、アグロスゲルのレーン2から9で標的遺伝子牝馬の増幅が成功したことが確認され、摘み取られたプラークの間で陽性ヒットが示されました。

野生型T4ファージDNAでは、5グリコシルヒドロキシエチル2プライムデオキシジンの相対存在量は高かった。NgTET処理されたT4ファージDNAでは、5グリコシルヒドロキシエチル2プライムデオキシジンのレベルは野生型と比較して大幅に減少しました。触媒不活性変異体NgTET D234 Aで処理したT4ファージDNAは高レベルの5グリコールヒドロキシエチル2プライムデオキシジンを保持した

回収されたT 4ファージの子孫は、野生型と比較して、5ヒドロキシメチル2プライムデオキシジンのレベルがほぼ回復したことを示しました。