高スループット形式を用いた微生物二次代謝物に対する葉の応答評価

私の研究室は植物微生物との相互作用を研究しており、最終的な目標は遺伝子学を使ってアザラシの抵抗性を向上させることです。最近の進展により、微生物の二次代謝物が植物の感受性や耐性を促進する上で重要な役割を果たすことが示されています。まずは直径4ミリのコルクボアを使って、1株あたり3枚の葉の円盤を集め、中央脈は避けましょう。

鋭い端で組織をマセレーションしないようにねじる動きを加えます。96ウェルプレートの各ウェルに、所定濃度の二次代謝物や溶媒処理を加え、最終体積200マイクロリットルに到達させます。葉盤を優しく井戸に入れます。

蓋を外した96ウェルプレートを真空ノズル付きのベルジャーに入れます。次に、真空ホースをベルジャーノズルに接続し、真空圧力を9.8ポンド毎平方インチで10秒間かけます。真空を止めて、10秒間ゆっくりと圧力を解放し、その後このサイクルを繰り返します。

次に蓋を96ウェルプレートに戻し、光源の下で軌道シェーカーで孵化させます。シェーカーの上23センチの位置で4時間保持。プローブを超純水で洗い、綿くずのないワイプで軽く軽く叩いて乾かします。

水の導電率の読み取りに注目してください。処理後4〜6時間の間に、葉盤を周囲の液体にプローブを浸して個々のウェルの導電率を測定・記録します。プローブが完全に浸透していることを確認するために、プレートを45度の角度で持ってください。

プローブを洗った後、時折水の導電率をテストしてプローブの安定性を確認します。その後、96ウェルプレートの上にプラスチック製の天井フィルムを貼り、軌道シェーカーに戻して一晩のインキュベーションを行います。過酸化酵素基質を準備するには、蒸留された滅菌水40ミリリットルを、攪拌棒付きのビーカーで70度まで加熱します。

5種類のアミノ酸サリチル酸を50ミリグラム加熱した水に溶かします。その後、水を加えて総体積を50ミリリットルにし、水酸化ナトリウムを使ってpHを6に調整します。光に敏感な溶液はアルミホイルで覆って保護します。

50ミリリットルの琥珀色円錐管に、超純水に1%の過酸化水素溶液を準備します。次に、アッセイ培地を生成するために必要な5アミノサリチル酸溶液1ミリリットルあたり10マイクロリットルの1%過酸化水素溶液を加えます。所定のタイミングで5回混ぜ、試料板の各ウェルから新しい板に50マイクロリットルを移します。

アッセイ培地を50マイクロリットル加え、室温で3分間培養します。反応を止めるには、各井戸に20マイクロリットルの通常の水酸化ナトリウム2を加え、プレートリーダーを使って595ナノメートルの各井戸の吸収を測定します。水と0.1%ジメチルスルホキシドは、イオン漏れと過酸化物酵素活性レベルを同様に生じさせ、ネガティブコントロールとしての使用を裏付けました。

1マイクロモルFLG 22による治療はイオン漏れ、ペルオキシダーゼ活性、カロース産生を有意に誘導し、堅牢な陽性対照群であることを確認しました。グラミリン処理は著しいイオン漏れとカロース生成を誘発しましたが、過酸化物酵素活性には変動的な影響がありました。10マイクロモルのスルファクチンは、イオン漏れに変化がなかった一方で、ペルオキシダーゼ活性とカロース産生の両方を誘導しました。

T-2毒素処理はペルオキシダーゼ活性を抑制し、カラス産生を誘導し、イオン漏れには影響を与えませんでした。当社のハイドロアッセイは、同じサンプル内で3つの異なるストレス反応をサンプリングでき、限られた量の微生物二次代謝物を最大限に活用できるようにしています。同じプレート内の96サンプルを比較できるため、研究者は集団遺伝学レベルのスクリーニングやシステム生物学を行い、植物微生物の相互作用を理解することができます。

私の研究は引き続き植物微生物の相互作用に焦点を当て、穀物作物の病害抵抗性を開発するために活用できる植物遺伝子の特性解析に注力していきます。