クロマチンおよびエピジェネティック老化の画像バイオマーカーを用いた単細胞老化の測定

私たちは、単一細胞分解能で老化と若返りを定量化するために設計された、画像ベースのクロマチンおよびエピジェネティックな年齢画像を開発しました。DNAメチル化時計は生物学的年齢を推定しますが、線形回帰に依存し、大規模なコホートを必要とし、サンプルを破壊するため、高コストで大規模または縦断的な研究には適していません。まず、凍結した臓器や組織を、ドライアイスの上に置いた冷えたモルタルに移します。

凍結組織に液体窒素を流し、事前に冷やした乳棒で徹底的に粉砕し、均一な細かい粉末になるまで粉砕します。事前に冷却された金属ヘラを使い、挽いた組織を複数の管に分けます。核を抽出した後、別のチューブで同比例のトリパンブルーと混混させます。

混合物を10マイクロリットル分のヘモサイトメーターに移すか、自動細胞計に入力してください。プレートマップにサンプルID、状態、バイオマーカーを含むすべてのメタデータを入力して検証し、CSVファイルをエクスポートします。次に、1孔あたり10,000個の核を20〜30マイクロリットルの容量で384ウェルプレートに供給します。

プレートを1000gで遠心分離し、加速を9、減速を4に設定し、4度の温度で10分間続けます。次に、8%のパラホルムアルデヒドとPBSを同量に加えて核を固定し、室温で10分間培養します。固定剤を除去した後、PBSに0.1モルグリシンを30マイクロリットル加え、室温で5分間培養します。

グリシン溶液を取り出し、100マイクロリットルのPBSでウェルを2回洗浄します。各ウェルからPBSを除去し、2%BSAと0.5%Triton X-100を含むブロッキング溶液30マイクロリットルをPBSに加えます。皿を室温で1時間孵化させます。

ブロッキング溶液を除去した後、4度の温度で25マイクロリットルの一次抗体溶液を培養します。次に、100マイクロリットルのPBSでウェルを3回洗浄し、それぞれの洗浄は室温で3分間続けます。二次抗体溶液25マイクロリットルを加え、4度Cで2時間培養します。

その後、100マイクロリットルのPBSで井戸を3回洗浄し、各洗浄は室温で3分間続けます。核をDAPIまたはHoechstで染色し、30マイクロリットルの染料を0.01ミリグラム/ミリリットルの濃度で加え、100マイクロリットルのPBSで一度洗って余分な染料を除去します。GitHubリポジトリからワークフロースクリプトをダウンロードしてください。

ダウンロードが完了したら、ファイルを解凍して内容を抽出します。クローン画像リポジトリを、正しいスクリプト実行のためにワークフローが想定するフォーマットに合うように整理してください。その後、LinuxやMac OSで動作する場合はターミナルアプリケーション、Windowsの場合はWSLアプリケーションを開きます。

ターミナルに必要なコマンドを入力してEnterキーを押すことで、作業ディレクトリをクローンされたリポジトリフォルダに変更します。CondaとPython バージョン3.10を使って新しい計算環境Image_workflowを作成し、Enterキーを押します。新たに作成されたConda環境をコマンド「conda activate Image_workflow」でアクティベートします。

起動環境内にPipインストーラーを使ってPythonパッケージマネージャーのPoetryをインストールします。その後、Poetryを使ってワークフローに必要なすべての前提Pythonパッケージをインストールします。次に、Conda環境内でCUDAを設定し、セグメンテーションステップ中にグラフィックス処理ユニットの機能を有効にします。

ターミナルアプリケーションを開き、フォルダをクローンに変えてください。以下のコマンドを入力してEnterキーを押してConda環境を起動します。ワークフローのメインファイルをコードやVS Code、Notepadなどのテキストエディタで開いて解析パラメータを設定してください。

出力を整理するための短いファイルシステムのセーフ識別子に変数pを割り当ててプロジェクト名を設定します。chsで特徴抽出用のチャネルリストを設定し、そのチャネルから特徴が必要な場合はセグメンテーションチャネルも含めて設定します。ImageIndexとチャネルラベルをキーとして使い、ファイル名から画像チャネル識別子を、先に保存した正確な大文字指定プレートマップの列ヘッダーにマッピングします。

次に、データセットルートにorgDataLoadPathを割り当て、必要に応じて画像サブフォルダにorgDataSubfolderを割り当て、outputルートにresultsSavePathを割り当ててデータ位置を設定します。imageFileFormatでファイル名拡張子を確認してください。次に、imageFileRegExを編集して、行、列、フィールド、Z位置、チャンネルなどの必要な部分にPython名付けのキャプチャグループを使います。

次に、segmentation_chのセグメンテーションチャネルを物体検出に使う核チャネルに設定します。illumiCorrectionを設定し、Trueに設定して基本モデルを計算・適用するかどうかを決めてください。次に、顕微鏡のメタデータを使って物理的なボクセルサイズ(マイクロメートル単位)をvoxel_dimでZYXとして設定します。

ファイルを保存し、各パラメータを確認した後にエディターを閉じます。最後に、ワークフロースクリプトを実行して画像読み取りを取得し、スクリプトを実行しながら端末を開いたままにします。結果を可視化し、生の画像表示をエクスポートして外部ソフトウェアで追加分析を行います。

誘導多能性幹細胞の代表的な画像では、DAPI染色、リジン27のトリメチル化ヒストンH3、リジン27のアセチル化ヒストンH3で染色された明確な分離核が示されました。肝筋および骨格筋の画像解析では、若年と高齢のサンプル間で有意な違いが見られ、老年のOSKMマウスでは高齢者に比べて画像が低下し、部分的な再プログラミングが示唆されました。個々の動物の分析では、古いOSKMサンプルの中には、古いマウスに比べて画像価値が著しく低下していることが示されました。

このプロトコルにより、研究者は異なる細胞型や組織間で単一の細胞分解能で染色質およびエピジェネティックな組織の変化を年齢に伴う変化を調査できます。私たちのイメージングベースの方法は非破壊的で、クロマチン構造を保存し、繰り返し測定が可能で、大規模または縦断的な研究においてよりコスト効率が良いです。今後の研究は、より多くのエピジェネティックマーカーの追加や、加減に関連した核内構造の研究に焦点を当てる予定です。