2025年10月17日
このプロトコルは、皮膚の構造と機能を複製するために、平面の生理学的に関連する気液界面培養システムを使用して、ヒト人工多能性幹細胞から毛包を含む皮膚オルガノイドを製造する方法を概説します。
私の研究の範囲は、希少疾患である色素性乾皮症(XAPA)の病原性を研究するためにUVB誘発ダメージモデルの開発を目指すことです。これらのin vitroモデルの課題の一つは、培養に約4か月かかるという非常に長い時間がかかることです。まだ新しい分野なので、もう少し詳しく特徴付ける必要があります。このモデルの利点は、hiPSC由来の3Dモデルであり、空気-液体界面が人間の皮膚構造を再現し、皮脂腺や毛包などの皮膚付属物を持つ培養です。
まず、空の15ミリリットル管に水酸化ナトリウムペレットを加えて1モル溶液を準備します。蒸留水をペレットに加え、チューブを渦巻きてペレットを溶かします。0.2マイクロメートルの孔径の膜フィルターを用いて、0.1モルの水酸化ナトリウム溶液を滅菌します。
氷の上で、10倍のPBS、5ミリモラー水酸化ナトリウム、蒸留水でコラーゲンタイプI溶液を希釈し、最終的な量を調整します。標準的な12ウェルプレートに150マイクロリットルのこのコラーゲン溶液を各インサートに分散します。プレートを37度Cで30分間インキュベートし、コラーゲンゲルが重合するのを待つ。
次に、加熱したメスでP1000の先端を切り、ワイドボアの先端を作ります。次に、広い開口部の先端を使って、少量の培地を10センチのペトリ皿の蓋に選んだ嚢胞構造を置きます。無菌メスで構造物の副産物を慎重に切除し、反対側は無菌鉗子で安定させます。
メスを使って、最初の切開に隣接する嚢胞性皮膚オルガノイドの両端から約1ミリメートルを切除します。滅菌鉗子を使って、皮膚の表層を優しく広げます。組織を2〜4つに切り分けます。
次に、滅菌鉗子を使って、表皮が上向きにしたコラーゲンコーティングされたインサートに各ピースを移動させます。標準的な12ウェルプレートの各ウェルに600マイクロリットルのOMMを加えます。インサートをOMMを含む12ウェルプレートに戻します。
次に、プレートを5%二酸化炭素を含む37度のインキュベーターに入れます。細胞の大部分を含む単一の高密度細胞集合体は、慎重に取り扱い遠心分離することでゼロ日までに形成されました。適切な表皮誘導により、3日目には骨材の外層に薄く透明な上皮が形成されました。12日目までに、嚢胞の一端に薄い間葉細胞の層が蓄積しました。
上皮と間葉の共誘導により、50日目から80日目の間に毛髪プラコードとペグが確認されました。目に見えるプラコードを持たないオルガノイドは非常に薄い上皮を示し、平面遷移から除外されました。平面皮膚オルガノイド生成のために選ばれたのは直径少なくとも5ミリメートルの分極性副産物を持つ嚢胞のみでした。
毛包は27日間の空気-液体界面培養の間に徐々に伸長していきました。皮脂腺は平面構造で14日目頃に確認されました。オルガノイド内の色素は時間とともに徐々に増加しました。
ヘマトキシリンとエオシン染色により、層状の上皮とそれを真皮から隔てる基底膜が明らかになりました。免疫蛍光染色により、平面皮膚オルガノイドにおける人間の皮膚に似た構造が確認されました。
本研究では、ヒト人工多能性幹細胞から毛包を含む皮膚オルガノイドを生成することに焦点を当て、色素性乾皮症を調査するためのUVB誘発損傷モデルを開発します。これらのオルガノイドは、ヒトの皮膚構造と機能を効果的に模倣するため、生理学的に適切な気液界面を用いて培養されます。
気液界面で培養されたヒトiPSC由来の平面状毛髪保持皮膚オルガノイドは、皮膚生物学および付属器形成を調査するための生理学的に妥当なin vitroシステムを提供します。このプラットフォームにより、環境ストレスや薬理剤に対する組織反応の予測モデリングが可能となり、皮膚科領域の研究開発におけるトランスレーショナルリサーチおよびメカニズムのリスク軽減を支援します。このアプローチは、初期段階の探索および前臨床評価のための堅牢で再現性のある皮膚モデルを実現し、ポートフォリオの信頼性を向上させます。
このオルガノイドシステムは、初期の発見から前臨床研究までを統合し、皮膚生物学における仮説検証、パスウェイの解明、および予測分析を可能にします。